Дифференциальная окраска хромосом

Используются методы дифференциальной окраски, позволяющие выявить в хроматидах чередование окрашенных и неокрашенных полос. Они называются бэндами и имеют специфическое и точное распределение. Используя метод дифференциальной окраски, в каждой хромосоме можно выявить реперы - важные элементы для идентификации хромосомы:

- чередование бэндов,

- центромера,

- теломеры.

Хромосомные реперы ограничивают районы хромосом, каждый из которых содержит несколько бэндов, а бэнды, в свою очередь, состоят из суббэндов.

- чередование полос не носит случайный характер, а отражает внутреннюю структуру хромосом, например распределение эухроматиновых и гетерохроматиновых участков

- распределение бэндов идентично для всех клеток одного организма и всех организмов данного вида, что используется для точной идентификации вида;

- метод позволяет точно идентифицировать гомологичные хромосомы,

- метод обеспечивает точную идентификацию каждой хромосомы,

- дифференциальная окраска позволяет выявить многие структурные нарушения хромосом (делеции, инверсии).

Характеристика  различных методов дифференциальной окраски хромосом

Название метода	Используемый краситель	Природа бэндов	Практическая роль
Метод G	Giemsa(раствор азур-эозина и эозина в глицерине и метиловом спирте)	Окрашенные - гетерохроматин; неокрашенные - эухроматин	Выявление численных и структурных    аномалий хромосом
Метод Q	Куинакрин (флюоресцентный краситель)	Окрашенные - гетерохроматин; неокрашенные - эухроматин	Выявление численных и структурных аномалий хромосом
Метод R (реверс)	Giemsa или флюоресцентный краситель	Окрашенные - эухроматин; неокрашенные - гетерохроматин	Выявление  численных и структурных аномалий хромосом
Метод C	Giemsa или флюоресцентный краситель	Окрашенные центромерный гетерохроматин	Анализ полиморфизма хромосом
Метод Т	Giemsa или флюоресцентный краситель	окрашенные - теломерный гетерохроматин	Анализ полиморфизма хромосом

Вопрос №13. Молекулярно-цитогенетические методы (FISH, CGH, SKY)

На основе методов молекулярного анализа нуклеиновых кислот была разработана серия новых техник изучения интерфазных хромосом, характеризующихся высокой специфичностью и точностью - методы гибридизации in situ (FISH, CGH, SKY).

Метод FISH - флуоресцентная гибридизация in situ - включает следующие этапы:

- создание зондов - однонитевых фрагментов ДНК, к которым присоединяют биотин или дигоксигенин;

- щелочная обработка препаратов in situ с целью денатурации хромосомной ДНК за счет разрыва водородных связей между двумя цепями ДНК;

- гибридизация хромосомной ДНК с зондом путем комплементарного связывания зонда со специфической последовательностью хромосомы;

- обработка препаратов веществами, которые избирательно связываются с биотином и дигоксегенином; для  биотина таким веществом является стрептовидин, для дигоксегенина - антидигоксигениновое антитело; 

- визуализация хромосом с помощью люминесцентного микроскопа на фоне неокрашенных хромосом.

Метод FISH используется для выявления:

- численных хромосомных аномалий в интерфазном ядре;

- структурных аномалий;

- сложных межхромосомных перестроек;

- локализации гена.

CGH - метод сравнительной геномной гибридизации, используется в онкологической цитогенетике для выявления делетированных (выпавших) или амплифицированных участков хромосом при некоторых типах опухолей. Делетированные участки, содержат гены-супрессоры опухолей, а амплифицированные участки - онкогены. Это позволяет использовать метод для картирования и клонирования генов, вовлеченных в канцерогенез.

Ген - супрессор опухолей (антионкоген, опухолевый супрессор) — ген, продукт которого обеспечивает профилактику опухолевой трансформации клеток.

Метод CGH заключается в следующем: ДНК, выделенную из опухоли и из нормальной ткани, метят разными флуорохромами. Меченую ДНК из опухоли и нормальной ткани гибридизуют с хромосомным препаратом, и по интенсивности свечения метки определяют участки, содержащие делеции и амплификации. Для обработки данных используют специальные программы компьютерного анализа.

SKY - спектроскопический анализ хромосом. Метод основан на использовании набора зондов и флуоресцентных красителей, имеющих сродство к определенным участкам хромосом. Каждая пара хромосом имеет уникальные спектральные характеристики. Используя интерферометр, аналог аппарата для измерения спектра астрономических объектов, можно определить незначительные вариации в спектральном составе хромосом, неразличимые человеческим глазом. Данные подвергаются компьютерной обработке по специальной программе, в результате чего каждая пара хромосом приобретает определенный цвет. Преимущество метода состоит в более точной идентификации гомологичных хромосом, которые имеют один и тот же цвет, и возможности выявления некоторых транслокаций. Метод используется в онкоцитогенетике для выявления в кариотипе опухолевых клеток даже очень незначительных по величине хромосомных аберраций.

Вопрос №14. Номенклатура хромосом человека (Международная система стандартизации)

Номенклатура хромосом человека основана на международной системе стандартизации, которая позволяет обозначить нормальный или патологический кариотипы с использованием специальных символов и знаков, отражающих число хромосом и тип нарушения - недостаток, избыток или перераспределение хромосомного материала.