Встраивание в мембрану и стабильность

 

В исследованиях по проводимости грамицидин может быть добавлен к сформированной мембране в качестве концентрированного спиртового раствора. При встраивании в липосомы грамицидин может быть добавленн таким же образом (то есть добавление концентрированного спиртового раствора к приготовленным липосомам) [33] или же совместным растворением с липидом перед формированием липосом [26]. Переход грамицидина в активную проводящую форму обычно сопроваждается нагреванием или озвучиванием [67].

Легкость всраивания грамицидина зависит от типа используемого липида и от соотношения липид/грамицидин [23]. В общем липиды с более выской температурой фазового перехода должны нагреваться более сильно для лучшего встраиваия грамицидина. Более того, в образцах, где приходится более 20 молекул липида на молекулу грамицидина нагревания до 30°С достаточно для встраивания грамицидина, а образци имеющие менее 10 молекул липида на молекулу грамицидина необходимо нагревать до 65°С в течение 48 часов для такого же встраивания [17].

Некоторые исследования показывают, что при низких соотношениях грамицидин/липид легкость встраивания зависит от того в каком растворителе до этого находился грамицидин (так называемая история растворения) [68]. Если липид-грамицидиновый комплекс перед образованием липосом был растворен в трифторэтаноле активный канал образуется немедленно вместе с формированием бислоя, если же использовался раствор в смеси хлороформ-метанол, то для встраивания необходимо сильное нагревание. Такая зависимомть исчезает при более высоких соотношениях грамицидин-липид, и не наблюдается никакого эффекта по свойствам проводимости. Это говорит о том, что взаимодействия с липидом играют важную роль в стабилизации активной проводящей структуры а фазовое состояние важно для процесса встраивания. Также природа комплексов грамициди-липид была изученна с помощью метода ЯМР [69], которые показали, что при низком соотношении грамицидин – липид липид образует гексагональную фазу, а не бислой. Это так же может быть причиной трудности встраивания грамицидина в данных условиях. С помощью спектров КД был охарактеризован процесс встраивания грамицидина в липид: до начала встраивания в предварительно приготовленные липосомы, грамицидин присутствует в виде двойной спирали в присутствии ионов [67]. При нагревании грамицидин переходит в одиночную спираль и встраивается в бислой. В промежуточные времена этого процесса спектр представляет собой линейную комбинацию спектров этих двух структур. Такие же процессы наблюдаются и в отсутствии иона. Одна из точек зрения на этот процесс заключается в том, что расплетание двойной спирали происходит до тех пор, пока N- конец c другим N-концом и такая структура будет почти эквивалентна спиральному димеру [17]. Такой процесс требует разрыва всех 28 водородных связей и является очень энергоемким, а затем снова их образования. Разница энергий между двух- и односпиральной конформациями не очень велика, так как они имеют почти одинаковое количество водородных связей. В общем, можно сказать, что детали данного процесса до конца не ясны.

 Возможно двухспиральная конформация имеет некоторую стабильность в бислое, но когда грамицидин становится ориентирован таким образом, что способен сформировать одиночную спираль, эта конформация становится предпочтительной, и, таким образом можно предположить, что спиральная конформация явлвется результатом специфического взаимодействия и ориентации грамицидина и липида. Теоретические [70] и экспериметальные [71] данные исследований с использованием липидов, в которых кислород карбонильной группы замещен на водород (имитируя таким образом простую эфирную связь) показали, что одиночная спираль грамицидина дестабилизированна в этих условиях. Таким образом взаимодействия между карбонильными группами липидов и определенными регионами молекулы грамицидина необходимы для формирования канальой структуры (одиночной спирали).