Структура грамицидинового канала, его фундаментальное и практическое значение.

Структура грамицидинового канала, его фундаментальное и практическое значение.

Оглавление

Введение

Химическая природа грамицидина А и его общие свойства

3. Биологическая роль грамицидина А

4. Структура грамицидина А

4.1 Конформации грамицидина А в органических растворителях

4.2 Структура грамицидина А в липидных мембранах и мембрано- подобных средах

4.3 Влияние связывания катионов на конформацию грамицидина А

4.4 Взаимоотношения между конформационными состояниями грамицидина А и проводящими формами.

4.5 Инженерия грамицидинового канала

5. Фундаментальное и практическое значение грамицидина А

6. Выводы

7. Список использованной литературы

Введение

 

Грамицидин А известен уже более 50 лет, но до сих пор остается в центре внимания. Являясь очень простым по своей химической структуре (всего 15 аминокислот) он обладает свойством образовывать ионселективный трансмембранный канал, не уступающий по характеристикам огромным по сравнению с ним белковым каналам, которые представлены, например, в нервной системе. Возможно, он является предшественником этих самых каналов и за время эволюции “оброс” всевозможными сенсорами напряжения, селективными фильтрами и другими регуляторными элементами. Если продолжать такое сравнение, то в плане детальной трехмерной структуры так мы пока не знаем ни один другой ионный канал, и применение грамицидина А для построения всевозможных моделей и теоретических исследований стало одним из путей к детальному пониманию различных молекулярных механизмов и структурно-функциональных взаимодействий. И, пожалуй, грамицидин А является одной из лучших таких моделей.

 

Биологическая роль грамицидина А

 

Грамицидин играет важную роль в процессе спророобразования у Bacillus brevis, определяя формирование нормальных спор. Показано, что штаммы, деффекные по синтезу грамицидина формируют споры с повышенной термочуствительностью. Грамицидин А спецефически ингибирует экспрессию отдельных (вегетативных) генов, определяя, таким образом, переход микроорганизма в покоящуюся стадию. Механизм такой регуляции до конца не ясен, но известно, что грамицидин А препятствует образованию комплекса РНК-полимеразы с ДНК, необходимого для инициации транскрипции. Предложенно две мишени связывания грамицидина: 1) грамицидин А специфически связывается с определенным участком ДНК и препядствует транскрипции. Такой механизм похож на действие другого пептидного антибиотика - тироцидина, так же синтезируемоего Bacillus brevis, который, связываясь с молекулой ДНК, препятствует образованию комплекса РНК-полимераза/ДНК, и как следствие ингибирует экспрессию определенных генов; 2) грамицидин А связывается с определенным участком РНК-полимеразы, чо приводит к изменению ее конформации и невозможностью связывания с ДНК.

 Возможно грамицидин А учавствует в сложном каскаде биохимических процессов вместе с другими антибиотиками (тироцидины-серия циклических пептидов, так же синтезируемых видом Bacillus brevis на стадии спорообразования), результатом которых является переход от вегетативного роста к споре.

Линейные грамицидины обладают антибиотическим и спермицидным эффектом направленным против грамположительных бактерий. Антибиотический эффект грамицидина определяется его способностью обрзовывать трансмембранный ионный канал, при чем этот эффект носит бактериостатический характер, что, по-видимому связано с истощением запасов АТФ, в организме на который действует грамицидин, который использует Na-K-АТФаза для востановления ионного градиента.

 

Структура грамицидина А

 

Не смотря на довольно простую первичную последовтельность грамицидина, определение природы его трехмерной структуры, не было стремительным и быстрым. Из-за его небольших размеров и, как следствие, сильной подвижности грамицидин, в зависимости от окружения, может существовать в виде семейства конформаций. Выделяют два основных типа структуры грамицидина: 1) Семейство двойных спиралей, предложенных Витчом (1974, [10]) и существующих в органических растворителях; 2) Семейство одиночных спиралей, предложенных Урри [11] и существующих в липидных мембранах.

В связи с необычностью химической структуры грамицидина, связаной с чередованием конфигураций входящих в его последовательность аминокислот стандартная номенклатура не может быть применена для данной модели, так как грамицидин не формирует ни одного типа структур, имеющихся в глобулярных белках.

Анализируя спектры КД грамицидина, а так же основываясь на теоретических расчетах конформационных энергий Урри и сотр. (1971 г. [11]) постулировали существование особой вторичной структуры, названной p4(L,D)-спиралью, являющейся гибридом 4,4₁₆ и 4,3₁₄ спиралей (4,4 – количество остатков на виток, 16 – количество атомов в витке). Рамачандран и Чандрасекаран [12], базируясь в основном на конформационно-энергетических взаимодействиях независимо обнаружили такую же вторичную структуру. Позже Урри и сотр. [13] предложили другую модель конформации грамицидина - p⁶(L,D) спираль, имеющую 6,3 остатка на виток и центральную полость размером 4 Ǻ, которая больше подходит для связывания и транспорта катионов, чем полость в 1,4 Ǻ, имеющаяся в p⁴(L,D) спирали. Димер полипептидных цепей, ассоциированных конец к концу (N-конец к N-концу, С-конец к С-концу или N-конец к С-концу) с конформацией p⁶(L,D) спираль имеет размер 25-30 Ǻ и, таким образом, может пронизывать липидный бислой и образовывать трансмембранный канал (Рис1А). Каждая спираль стабилизируется 12-ю внутримолекулярныму водородными связями, а димер (при любых способах ассоциации) – при помощи 6-ти межмолекулярных водородных связей.

Альтернативной структурой, предложенной Витчом и сотр в 1974 году [10], является двойная p - спираль, в которой два мономера закрученны друг на друга. Ассоциация между мономерами в такой спирали может быть как параллельной (­­), так и антипараллельной (­¯). Расположение водородных связей в двойных спиралях грамицидна такое же как и в b-слое, который, как было предположенно, и образуется сначала между двумя молекулами грамицидина, а затем сворачивается в спираль. Витч и сотр. Так же предложили, что такие спирали с 6-7 остатками на виток будут иметь размеры, подходящие для пронизывания липидного бислоя и транспорта ионов. Дальнейшие исследования такого типа моделей показали возможность существования антипараллельных двойных спиралей с 5,6 и 7,2 остатка на виток (рис1Б).

Рисунок 1.

Схематическое изображение спиральных димеров (структура Урри) (А) и двухспиральных димеров (структура Витча) (В) грамицидина.

 

 

Название p-спираль, предложенное вначале для описания конформаций грамицидина было не совсем корректным, так как это название обычно используется для 4,4₁₆-спиралей, имеющих типичную ориентацию водородных связей (все амидные группы пептидного остова в данной структуре обращены в оддну сторону, что в результате дает сильный суммарный диполь), в то время как спирали предложенные для грамицидина не имеют такую геометрию (аминогруппы пептидного остова имеют различное направление, не образуя, таким образом, диполь). Ко всему прочему значения углов f и y, расчитанные для данных структур, отличаются от таковых в p-спиралях описанных Рамачандраном и Рамакришнаном [14]. Таким образом предложили называть такие структуры b-спиралями, что лучшим образом определяет образование водородных связей.

Не смотря на явные различия двух предложенных структур, спиральные димеры (b-спирали) и двухспиральные димеры (bbспирали) имеют много общего и могут образовывать структуры почти идентичных размеров, и, более того, способ образования водородных связей одинаков в обоих случаях. Первичная последовательность грамицидина не делает жестких ограничений для направления закручивания спиралей, и они могут быть как право-, так и левозакрученными. Этот потенциальный полиморфизм связан с тем, что чередование L- и D-аминокислот не накладывает жестких ограничений на направление закрутки спирали. Так же, в обоих типах предложенных структур, боковые цепи аминокислон располагаются с наружней стороны спирали и ни одной боковой цепи нет во внутренней полости. В результате внутренняя полость (пора) данных спиралей намного больше таковой для a-спиралей. Это связанно с природой β-слоя: в последовательностях имеющих только L-аминокислоты, при образовании b-слоя боковые цепи обращены поочередно в разные стороны от плоскости слоя, а в случае чередования L- и D-аминокислот все боковые радикалы будут обращены в одну сторону от плоскости β-слоя и, таким образом при сворачивании такой структуры в спираль они все окажутся снаружи, а внутри образуется пора, выстланная карбонильными группами пептидных связей, способная пропускать воду и ионы.

 

Данные последних исследований методами дифракции ренгеновских лучей, ЯМР-, КД- и ИК – спектроскопии, а так же компьютерное моделирование и исследование химически модифицированных аналогов позволяют детально понять природу структуры грамицидинового канала и его конформационных переходов. Результатом использования такого широкого набора методов является возможность по-новому взглянуть на конформационные взамиоотношения в молекуле грамицидина и сравнить их с существующими моделями.

Оглядываясь назад, мы видим что все предложенные изначально конформационные модели являются корректными, отображают общие принципы упаковки полипептидного остова и не противоречат экспериментальным данным, что очень важно для применения в исследовании других молекул.

В качестве модели грамицидин был использован для изучения липид – белковых взаимодействий [77], ионной проводимости [78], влияния трехмерной структуры на функцию [17]. Но применять эту модель нужно очень осторожно, из-за маленьих размеров, молекула грамицидина очень подвижна и принмает множество конформаций в зависимости от внешних условий, в то время как “большие” ионные каналы, состоящие из длинных полипептидных цепей, а иногда и нескольких субъедениц, имеют довольно стабильную пространственную структуру в условиях, близких к физиологическим (или же имеют небольшие вариации прис охранении общего способа укладки полипептидной цепи). Таким образом, определяя еденичную трехмерную структуру “большого” канала мы с большой вероятностью можем сказать что эта конформация и представляет из себя активный канал.

Сначала было предположенно, что структурно функциональные отношения в грамицидине более просты для понимания, в связи с тем, что ионсвязывающие сайты образованны только карбонильными группами полипептидного остова, а не боковыми радикалами аминокислот, и было предположенно, что на связывание ионя влияет только конформация полипептидного остова. При более детальном исследованиии аналогов с измененной первичной последовательностью выяснилось, что даже находясь на внешней стороне канала и далеко от сайтов связывания боковые радикалы аминокислот оказывают сильное влияние на свойства проводимости и конформационной стабильности, что так же должно быть учтено в модельных исследованиях.

 

Список литературы

 

 

1. Hotchkiss R.D., Dubos R.J. 1940, Journal of Biological Chemistry: v.132 p.791

2. Sarges R., Witkop B.,1964 Journal of American Chemical Society, vol.86, p.1862

3. Sarges R., Witkop B., 1965 Journal of American Chemical Society, vol 87, p.2011

4. Sarges R., Witkop B., 1965 Journal of American Chemical Society, vol 87, p.2027

5. Sarges R., Witkop B, 1965 Biochemistry, vol. 4, p.2491

6. Weinshtein S., Wallace B., et.al., 1980 Journal of Molecular Biology, vol 143, p1

7. Gross E., Witkop B., 1965 Biochemistry, vol. 4, p:2495

8. Koeppe R.E. II, Paczkovski J.A., Whaley W.L., 1985 Biochemistry, vol. 24, p.:2822

9. Gause G.F., Brazhnikova M.G., 1944 Lancet, vol. 247, p.:715

10. Veatch W.R., Fossel E.T., Boult E.R., 1974 Biochemistry, vol. 13, p.5249

11. Urry D.W., 1971 Proc Natl Acad Sci U S A, vol.68, p672

12. Ramachandran G.N., Chandrasekaran R, 1972 Ind. J. Biochem. Biophys., vol.9, p.1

13. Urry D.W., 1971 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, vol 68, p.1907

14. Ramakrishnan G.N., Ramachandran G.N., 1965 Biophys. J., v.5, p909

15. Fossel E.T, Veatch W.R, Ovchinnikov Y.A., Buolt E.R., 1974 Biochemistry, vol.13, p5264

16.  Veatch W.R, Boult E.R., 1974 Biochemistry, vol.13, p5257

17. Wallace B.A., 1990 Annu. Rev.Biophys. Biophys Chem., vol.19, p.127

18. Bystrov V.F., Arseniev A.S., 1988. Tetrahedron, vol.44, p.925

19. Langs D.A., 1988 Science, vol.241, p.188

20. Сычев С.В., Невская Н.А., Иорданов С., Мирошников А.И., Иванов В.Т. 1980, Биоорганическая химия, том 9, стр.121

21. Hawkes G.E., Lian L.-Y., Randall E.W. 1987, Eur. J. Biochem., vol.166, p. 437

22. Isbell B.E., Rice-Evans C, et.al. 1972 FEBS Lett., vol 25, p. 192

23. Killian J.A., Prasad K.U., et.al. 1988 Biochemistry, vol.27, p.4848

24. Wallace B.A., Veatch W.R., Boult E.R. 1981 Biochemistry, vol. 20., p. 5754

25. Weinstein S., Durkin J.T., et.al. 1985 Biochemistry, vol.24, p. 4374

26. Weinstein S., Wallace B.A., Boult E.R, et.al 1979 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, vol. 76, p.4230

27. Weinstein S., Wallace B.A, et.al 1980 J. Mol.Biol., vol.143, p.1

28. Wallace B.A. 1986 Biophys. J., vol. 49, p.295

29. Kleinfeld A.M., 1987 Curr. Top. Membr. Tansp., vol.29, p.1

30. Scarlata S.F., 1988 Biophys.J., vol.54, p.1149

31. Veatch W.R, Mathies R., et.al. 1975 J.Mol.Biol., vol.99, p.75

32. Veatch W.R, Styer L. 1977 J.Mol.Biol, vol.113, p.89

33. Masotti L., Spisni A., et.al. 1980 Cell Biopys., vol.2, p.241

34. Bamberg E., Lauger P., 1977 J.Membr. Biol., vol.35, p.351

35. Killian J.A., de Kruijff B., et.al. 1983 Biochim. Biophys. Acta., vol.78, p. 141

36. Cornell B., Separovic F., et.al. 1988 Biophys.J., vol. 53, p. 67

37. Arseniev A. S Ovchinnikov Yu, A.., Barsukov, I. L.Bystrov, V. F,.Lomize, A. L. 1985 FEBS Lett., vol.186, p.168

38. Durkin J.T., Andersen O.S., et.al. 1986 Biophys.J., vol.49, p.118

39. Szabo G., Urry D. W. 1979 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, vol.68., p.672

40. Bradley R.J., Urry D.W., et.al. 1978 Science, vol.200, p.435

41. Koeppe R.E. & Andersen O.S. 1996 Annu. Rev. Biophys.Biomol. Struct., vol. 25, p.231-258

42. Sychev, S. V.Barsukov, L. I.Ivanov, V. T. 1993 Eur Biophys J, vol.22, p. 279-88.The double pi pi 5.6 helix of gramicidin A predominates in unsaturated lipid membranes

43. Hladky S.B., Haydon D.A., 1972 Biochim. Biophys. Acta., vol.274, p.294

44. Eisenman G., Sandblom J.P., Neher E. 1978 Biophys.J., vol.22, p.307

45. Mazet J.-L., Andersen O.S.,Koeppe R.E. 1984 Biophys.J., vol.45, p. 263

46. Veatch W. R., Durkin J.T. 1980 J.Mol.Biol., vol.14, p.411

47. Hinton J.F., Whaley W.L., et.al. 1986 Biophys.J., vol.50, p. 539

48. Dani. J.A., Levitt D.G. 1981 Biophys.J., vol.35, p.501

49. Hinton J.F., Fernandez J.Q., et.al. 1989 Biophys.J., vol.55, p.327

50. Wallace B.A. 1983 Biopolymers, vol.22, p. 397

51. Hinton J.F., Koeppe R.E. II, et.al. 1986 Biophys.J., vol.49, p.571

52. Urry D.W., Trapane T.L., et.al. 1983 Science, vol.221, p.1064

53. Cornelis A., Laszlo P., 1989 Biochemistry, vol.18, p.2004

54. Arseniev A.S., Barsukov I.L., Bystrov V.F. 1985 FEBS Lett., vol.180, p.33

55. Koeppe R.E.II, Berg J.M., et.al. 1979 Nature, vol.279, p.723

56. Wallace B.A., Ravikumar K. 1988 Science, vol.241, p.182

57. Sung S. –S., Jordan P. C. 198 Biophys.J., vol.54, p. 519

58. Lee W.K., Jordan P. C.1984 Biophys.J., vol.46, p.805

59. Urry D.W., Alonso-Romanovsky S., et.al. 1984 J.Membr.Biol., vol. 71, p.205

60. Trudelle Y., Daumas P., et.al. 1987 FEBS Lett., vol.216, p.11

61. Barret Russel E.W., Weiss L.B., et.al. 1986 Biophys.J., vol.49, p.673

62. Ovchinnikov Y.A., Ivanov V.T. 1983 In Conformation in Biology, ed. R. Srinivasan, R.H. Sarma, p.155, New York: Academic

63. Busath D.D., Andersen O.S., Koeppe R.E.II., 1987 Biophys.J., vol.51, p.79

64. Busath D.D., Szabo G. 1981 Nature vol.294, p.371

65. Busath D.D., Szabo G. 1988 Biophys.J., vol.53, p.689

66. Andersen O.S., Koeppe R.E., et.al. 1987 In Transport through membranes, ed. K.Ygi, B.Pullman, p.295. Tokyo: Academic

67. Wallace B.A. 1985 Biophys.J., vol.45, p.114

68. LoGrasso P.V., Moll F.III, Cross T.A., 1988 Biophys.J., vol.54, p.259

69. Killian J.A., de Kruijff B., 1985 Biochemistry vol.24, p.7881

70. Meulendijks G. Sonderkamp T., et.al., 1989 Biochim. Biopphys. Acta vol.979, p.321

71. Waalace B.A., Veatch W.R., Boult E.R. 1981 Biochemistry vol.20, p.5754

72. Durkin J.T., Koeppe RE II, Andersen O.S. 1990 J.Mol.Biol. vol.211, p.221

73. Fonseca V., Daumas P., et.al. 1992 Biochemistry vol.31, p.5340

74. Mukherjee P.K. & Paulus H. 1974 Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.74, no.2

75..Sarcar. N et al., 1974 Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.74, no.4, pp.1478-1482,

76. Langs D.A. 1989 Biopolymers vol.28(1), p.259

77. Killian J.A., Taylor MJ, Koeppe DE II. 1992 Biochemistry vol.31, p.11283

78. Finkelstein A, Andersen OS. 1981. J.Membr. Biol. vol.59, p.155

79. Hodges RS, Merrifield RB, 1975 Anal. Biochem. vol.65, p.241

80. Paul BW, Ten Kortenaar, et.al. 1986 Int. J.Pep. Pro. Res., vol.27, p.398

 

 

1. Овчинников Ю.А., Иванов В.Т, Шкроб А.М.; ''Мембрано-активные комплексоны", Москва, "Наука", 1974, стр.40-47, 174.

2. N.Sarcar et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.74, no.4, pp.1478-1482, 1974

3. P.K. Mukherjee & H. Paulus Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.74, no.2, 1974

4. Hladky & Haydon, Nature, vol.255, pp. 451-453, 1970

5. W.R Veatch & E.R. Boult, Biochemistry vol.13 no. 26, 1974, pp.5257-5261

6. D.W. Urry, Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.68 pp.672-676

7. Ramachandran & Chandrasekaran, Ind. J. Biochem. Biophys., vol.9, pp1-11, 1972

8. E. Fossel, W. R. Veatch, Y. A. Ovchinnikov, E. Boult, Biochemistry vol.13 no. 26,

1974, pp 5264-5275

9. Шепель Е.Н. и др., Биоорг. химия, 2, 581-593 (1976)

10. Cычев С.В., Фонина Л. А., Иванов В.Т., Биоорг. химия, 8, 1080-1088 (1984)

11. Ivanov V.T., "From structure towards the molecular mechanism of action", in

Peptides 1982

12. D.W. Urry, in "Spectroscopy of Biological Molecules", 487-510

13. Wallace B.A. & Boult E.R. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.75, 1775-1779

14. Wallace B.A., W.R. Veatch & E.R.Boult (1981), Biochemistry,20: 5754-5760.

15. Сычев С.В., Невская, Иорданов С.Т. и др. (1980), Биоорг. химия, 9: 121-151

16. Arseniev A.S., Bystrov V.F., V.T.Ivanov & Yu.A. Ovchinnikov (1984), FEBS

(Fed. Eur. Biochem. Soc.) Lett. 165:51-56.

17. Arseniev A.S., Barsukov I.L., Bystrov V.F., A.L.Lomize & Yu.A. Ovchinnikov

(1985), FEBS (Fed. Eur. Biochem. Soc.) Lett.186: 168-174.

18. Urry D.W., J.T. Walker, & T.L. Trapane (1980), J. Membr. Biol. 69: 225-231.

19. Arseniev A.S., Barsukov I.L. & Bystrov V.F (1985) FEBS (Fed. Eur. Biochem

. Soc.) Lett. 180: 33-39.

20. S.V.Sychev, S.V. Sukhanov, L.I. Barsukov & V.T. Ivanov (1996), J. Pep. Sci.

2:141-156.

21. N. Mobashery, C. Nielsen, O.S. Andersen (1997), FEBS (Fed. Eur. Biochem.

Soc.) Lett. 412: 15-20.

22. Cornell B.A.,& M.A. Keniry (1983), Biochim. Biophys. Acta. 732: 705-710.

23. P. Daumas, D. Benamar & other., (1991) Int. J. Peptide Protein Res. 38: 218-228.

24. Wallace B.A, (1986), Biophys. J. 49: 295-306.

25. V. Krchnak, J. Vagner, P. Safar & M. Lebl (1988), Collection Czechoslovak

Chem. Commun. 53: 142-148.

26. K. U. Prasad, S. Alonso-Romanovski & other, (1986) Biochemstry, 25: 456-463

27. K. Bauer, R. Roskoski, H. Kleinkauf & F. Lipmann (1972) Biochemistry, 11: 3266-3270.

28. C.G Fields, G.B. Fields & other, (1989) Int. J. Peptide Protein Res., 33: 298-303.

 

 

Структура грамицидинового канала, его фундаментальное и практическое значение.

Оглавление

Введение