Влияние связывания ионов на конформацию грамицидина

 

Грамицидин способен транспортировать одновалентные катионы через фосфолипидные мембраны [43].Его разная селективность по отношению к различным представителям группы щелочных металов определяется как размером конкретного иона, так и значением его энергии гидратации. Относительные константы афинности с натрием, калием, рубидием, цезием и талием были исследованны с помощью метода регистрации одиночных каналов [44], изучения аналогов грамицидина [45],равновесного диализа [46], ЯМР [47], проводимости воды [48] и показали, что константа связывания талия на порядок меньше чем цезия и на два порядка меньше чем натрия. Дальнейшие исследования показали, что с каналом одновременно могут связываться два иона, причем константа связывания первого катиона больше чем второго [49], что видимо, связано с электростатическим отталкиванием.

Двухвалентные катионы блокируют проведение одновалентных [39] и нетранспортируются грамицидиновым каналом. Последние исследования [49] показали, что частично дегидратированный двухвалентный катион связыватся с грамицидином с большей энтальпией чем одновалентный. Таоке сильное взаимодействие является следствием низкой подвижности двухвалентных катионов в грамицидиновом канале.

Связывание анионов с грамицидиновым каналом не было продемонстрированно, хотя существуют некоторые доказательства их проводимости и влияния на транспорт катионов [44].

Взаимодеиствие грамицидина с одновалентными катионами оказывает слабое влияние (или вовсе не влияет) на форму его спектра КД [50], и, таким образом, на конформацию грамицидина.

Комплексы грамицидина с лизолецитином так же связывают катионы, они были использованны для определения констант связывания [51] и локализации сайтов связывания. В данной системе наблюдается изменение формы спектра КД при связывании катионов (в отличие от комплекса с додецилсульфатом натрия, где такой эффект отсутствует), что свидетельствует об изменении конформации при таком взаимодействии [52].

В органических растворителях наблюдается сильное изменение структуры грамицидина при связывании с катионом, что демонстрируется изменением как формы, так и амплитуды спектра КД.

При исследовании связывания цезия с грамицидином в растворе наблюдается постепенное изменение формы спектра КД, что свидетельствет о плавном переходе из формы свободного грамицидина в ион-связанною. Эти данные были использованны для определения констант связывания цезия, которые составили К₁=170 М^-1 – для первого (более крепкого)сайта, и К₂=20 М^-1 – для второго (более слабого) сайта связывания. Константа связывания для лития, определенная тем же методом имеет величину на порядок меньшую, чем таковая для цезия [28]. Константа связывания для натрия была определенны методом ²³Na ЯМР [53] и составила 4 М^-1. Константы связывания других ионов не были определенны, в связи с их низкой аффинностью, что делает такие изимерения довольно сложными.

В растворе хлороформ-метанол в присутствии тиоцианата цезия грамицидин (по данным двумерной ЯМР-спектроскопии) представляет собой правозакрученную антипараллельную двойную спираль с 7,2 остатка на виток (b^7,2-спиральный димер) и сдвигом в 1,5 остатка, что свидетельствует о том, что ¹Val не участвует в образовании водородных связей [54] (рис.6). Кристаллические структуры грамицидина дают дополнительную информацию о его трехмерной структуре и, более того, возможность формирования кристаллов в отсутствии и в присутствии ионов позволяют изучить их влияние. Обе ионсвязанная и ионсвободная кристаллические структуры грамицидина являются левозакрученными антипараллельными двойными спиралями и отличаются от форм в растворе значениями углов f и y, направлением образования водородных связей и регулярностью укладки полипептидного остова. Ионсвободная кристаллическая форма длиннее (31 Ǻ) и уже (внутренняя полость довольно узкая и в некоторых местах не способна связывать ион) чем кристаллическая форма с тиоцианатом цезия (26 Ǻ в длину, 4,9 Ǻ – внутренний диаметр поры, в которой помещается ион цезия) [17].

 

                               А                                      Б

 

.Рисунок 6.

СРК Изображение правозакрученного антипараллельного двухспирального димера грамицидина с 7,2 остатка на виток (ββ^7,2 -двухспиральный димер) (PDB Code: 1AV2) в компелексе с цезием. А – вид сверху и ион цезия; Б – вид сбоку. Две молекулы грамицидина в димере показанны разными цветами (красный и синий).

 

Конформация полипептидного остова в ион-связанной форме грамицидина более упорядоченна, хотя и имеются некоторые вариации углов f и y в районах прилегающих к сайтам связывания катионов, а водородные связи направленны почти параллельно оси спрали [55]. Это говорит о том что данная спираль с большей вероятностью имее 6,4 остатка на виток, чем 7,2.

Сравнение ион-свободных и ион-связанных форм грамицидина показало, что при связывании происходит переупаковка и адаптация трехмерной структуры под конкретный катион. Такая перестройка возможна при реорганизации водородных связей. Так же наблюдается локальное расширение спирали в местах связывания иона и реориентация карбонильных групп пептидного остова, участвующих в связывании ионов [17].