Биологическая роль грамицидина А

 

Грамицидин играет важную роль в процессе спророобразования у Bacillus brevis, определяя формирование нормальных спор. Показано, что штаммы, деффекные по синтезу грамицидина формируют споры с повышенной термочуствительностью. Грамицидин А спецефически ингибирует экспрессию отдельных (вегетативных) генов, определяя, таким образом, переход микроорганизма в покоящуюся стадию. Механизм такой регуляции до конца не ясен, но известно, что грамицидин А препятствует образованию комплекса РНК-полимеразы с ДНК, необходимого для инициации транскрипции. Предложенно две мишени связывания грамицидина: 1) грамицидин А специфически связывается с определенным участком ДНК и препядствует транскрипции. Такой механизм похож на действие другого пептидного антибиотика - тироцидина, так же синтезируемоего Bacillus brevis, который, связываясь с молекулой ДНК, препятствует образованию комплекса РНК-полимераза/ДНК, и как следствие ингибирует экспрессию определенных генов; 2) грамицидин А связывается с определенным участком РНК-полимеразы, чо приводит к изменению ее конформации и невозможностью связывания с ДНК.

 Возможно грамицидин А учавствует в сложном каскаде биохимических процессов вместе с другими антибиотиками (тироцидины-серия циклических пептидов, так же синтезируемых видом Bacillus brevis на стадии спорообразования), результатом которых является переход от вегетативного роста к споре.

Линейные грамицидины обладают антибиотическим и спермицидным эффектом направленным против грамположительных бактерий. Антибиотический эффект грамицидина определяется его способностью обрзовывать трансмембранный ионный канал, при чем этот эффект носит бактериостатический характер, что, по-видимому связано с истощением запасов АТФ, в организме на который действует грамицидин, который использует Na-K-АТФаза для востановления ионного градиента.

 

Структура грамицидина А

 

Не смотря на довольно простую первичную последовтельность грамицидина, определение природы его трехмерной структуры, не было стремительным и быстрым. Из-за его небольших размеров и, как следствие, сильной подвижности грамицидин, в зависимости от окружения, может существовать в виде семейства конформаций. Выделяют два основных типа структуры грамицидина: 1) Семейство двойных спиралей, предложенных Витчом (1974, [10]) и существующих в органических растворителях; 2) Семейство одиночных спиралей, предложенных Урри [11] и существующих в липидных мембранах.

В связи с необычностью химической структуры грамицидина, связаной с чередованием конфигураций входящих в его последовательность аминокислот стандартная номенклатура не может быть применена для данной модели, так как грамицидин не формирует ни одного типа структур, имеющихся в глобулярных белках.

Анализируя спектры КД грамицидина, а так же основываясь на теоретических расчетах конформационных энергий Урри и сотр. (1971 г. [11]) постулировали существование особой вторичной структуры, названной p4(L,D)-спиралью, являющейся гибридом 4,4₁₆ и 4,3₁₄ спиралей (4,4 – количество остатков на виток, 16 – количество атомов в витке). Рамачандран и Чандрасекаран [12], базируясь в основном на конформационно-энергетических взаимодействиях независимо обнаружили такую же вторичную структуру. Позже Урри и сотр. [13] предложили другую модель конформации грамицидина - p⁶(L,D) спираль, имеющую 6,3 остатка на виток и центральную полость размером 4 Ǻ, которая больше подходит для связывания и транспорта катионов, чем полость в 1,4 Ǻ, имеющаяся в p⁴(L,D) спирали. Димер полипептидных цепей, ассоциированных конец к концу (N-конец к N-концу, С-конец к С-концу или N-конец к С-концу) с конформацией p⁶(L,D) спираль имеет размер 25-30 Ǻ и, таким образом, может пронизывать липидный бислой и образовывать трансмембранный канал (Рис1А). Каждая спираль стабилизируется 12-ю внутримолекулярныму водородными связями, а димер (при любых способах ассоциации) – при помощи 6-ти межмолекулярных водородных связей.

Альтернативной структурой, предложенной Витчом и сотр в 1974 году [10], является двойная p - спираль, в которой два мономера закрученны друг на друга. Ассоциация между мономерами в такой спирали может быть как параллельной (­­), так и антипараллельной (­¯). Расположение водородных связей в двойных спиралях грамицидна такое же как и в b-слое, который, как было предположенно, и образуется сначала между двумя молекулами грамицидина, а затем сворачивается в спираль. Витч и сотр. Так же предложили, что такие спирали с 6-7 остатками на виток будут иметь размеры, подходящие для пронизывания липидного бислоя и транспорта ионов. Дальнейшие исследования такого типа моделей показали возможность существования антипараллельных двойных спиралей с 5,6 и 7,2 остатка на виток (рис1Б).

Рисунок 1.

Схематическое изображение спиральных димеров (структура Урри) (А) и двухспиральных димеров (структура Витча) (В) грамицидина.

 

 

Название p-спираль, предложенное вначале для описания конформаций грамицидина было не совсем корректным, так как это название обычно используется для 4,4₁₆-спиралей, имеющих типичную ориентацию водородных связей (все амидные группы пептидного остова в данной структуре обращены в оддну сторону, что в результате дает сильный суммарный диполь), в то время как спирали предложенные для грамицидина не имеют такую геометрию (аминогруппы пептидного остова имеют различное направление, не образуя, таким образом, диполь). Ко всему прочему значения углов f и y, расчитанные для данных структур, отличаются от таковых в p-спиралях описанных Рамачандраном и Рамакришнаном [14]. Таким образом предложили называть такие структуры b-спиралями, что лучшим образом определяет образование водородных связей.

Не смотря на явные различия двух предложенных структур, спиральные димеры (b-спирали) и двухспиральные димеры (bbспирали) имеют много общего и могут образовывать структуры почти идентичных размеров, и, более того, способ образования водородных связей одинаков в обоих случаях. Первичная последовательность грамицидина не делает жестких ограничений для направления закручивания спиралей, и они могут быть как право-, так и левозакрученными. Этот потенциальный полиморфизм связан с тем, что чередование L- и D-аминокислот не накладывает жестких ограничений на направление закрутки спирали. Так же, в обоих типах предложенных структур, боковые цепи аминокислон располагаются с наружней стороны спирали и ни одной боковой цепи нет во внутренней полости. В результате внутренняя полость (пора) данных спиралей намного больше таковой для a-спиралей. Это связанно с природой β-слоя: в последовательностях имеющих только L-аминокислоты, при образовании b-слоя боковые цепи обращены поочередно в разные стороны от плоскости слоя, а в случае чередования L- и D-аминокислот все боковые радикалы будут обращены в одну сторону от плоскости β-слоя и, таким образом при сворачивании такой структуры в спираль они все окажутся снаружи, а внутри образуется пора, выстланная карбонильными группами пептидных связей, способная пропускать воду и ионы.