Порівняння між частковими каріограмами пробанда з підозрою на синдром мікроделеції 22 q 11. 2 та його матері.

Пацієнт	Каріотип	Гомоло-ги хромосоми 12	Гомологи хро мосоми 22	Структурно перебудовані хромосоми в каріотипі:
пробанд	46,XX,der(12) t(12;22) (q12;q11.2)mat,-22
		N N	N	der(12)t(12;22)(q12;q11.2)
мати пробанда	46,XX,t(12;22) (q12;q11.2)
		N	N	der(12)t(12;22)	der(22)t(12;22)

 

У іншому випадку за допомогою аналізу хромосом метафазної конденсації у пробанда з підозрою на СПВ виявлено робертсонівську транслокацію між хромосомами 14 та 22. При цитогенетичному аналізі в родині пацієнта встановлено: каріотип матері – 46,XX, каріотип сестри – 46,XX. У батька виявлено таку саму структурну перебудову, як і у пробанда. Дитина мала характерні для СПВ клінічні ознаки, тому наявність структурної перебудови батьківського походження не відігравала визначальної ролі у виникненні та розвитку клінічної картини. В той же час, у дитини не було виявлено делеції критичної ділянки хромосоми 15, що потребувало подальшого аналізу із застосуванням більш чутливих методів.

При дослідженні каріотипу пацієнта з підозрою на синдром мікроделеції 22q11.2 та характерними клінічними ознаками стандартним цитогенетичним методом виявлено інверсію хромосоми 9, яка оцінюється як поліморфізм. Інших змін хромосомного матеріалу на рівні метафаз у каріотипі виявлено не було, тому діагноз на даному етапі дослідження не встановлено.

Всього, за результатами стандартного цитогенетичного аналізу верифіковано діагноз у 7 пацієнтів з 78 (8,97%). Застосування стандартного цитогенетичного методу не дозволило верифікувати діагноз у 71 особи (85,89%), що потребувало подальшого дослідження їхнього каріотипу із використанням чутливіших методів діагностики ХП.

Високочутливий цитогенетичний метод застосованоу 74 осібз метою виявлення мікроделеції в критичних ділянках досліджуваних хромосом 4, 5, 7, 15, 22 та для уточнення точок розривів - з’єднання у структурно перебудованих хромосомах, виявлених під час стандартного цитогенетичного методу.

В результаті проведення аналізу хромосом прометафазної конденсації попередній клінічний діагноз - синдром мікроделеції 22q11.2 підтверджено у трьох пробандів з 31 особи (3,85%), у яких стандартним методом делецію критичної ділянки не було виявлено. З метою запобігання хибно позитивних чи хибно негативних результатів проведено перевірку отриманих даних за допомогою FISH-методу. В одному випадку у пацієнта та у його матері за допомогою високочутливого цитогенетичного методу уточнено точки розривів-з’єднання при структурній перебудові, що не вдалося визначити стандартним цитогенетичним методом: каріотип пробанда після аналізу точок розривів-з’єднання було уточнено з 46,XX,der(12)t(12;22)(q12;q11.2)mat,-22 на 46,XX,der(12)t(12;22)(q13.2;q11.2)mat,-22. В той же час, навіть після застосування високочутливого методу, питання про наявність чи відсутність критичної ділянки q11.2 хромосоми 22 у цього пробанда залишилося відкритим, і даний випадок потребував подальшого дослідження з використанням більш чутливих методів. Для 61 особи (78,21%) остаточний діагноз на даному етапі не встановлено.

Таким чином, використання цитогенетичних (стандартного та високочутливого) методів дозволило верифікувати діагноз у 10 пацієнтів з 78 осіб та виявити батьківське походження дериватних хромосом у двох випадках. Крім того виявлено інші хромосомні перебудови без участі критичних ділянок у трьох пацієнтів. Інформативність цитогенетичних методів для підтвердження попереднього клінічного діагнозу СВХ, синдрому „котячого крику”, ССМ та синдрому „котячого ока” склала 100%, синдрому мікроделеції 22 q11.2 – 3,85%, для клінічних діагнозів СВБ та СПВ – 0%. Загальна інформативність цитогенетичних методів склала 12,82%.

Молекулярно-цитогенетичне дослідження проведено у 71 із 78 пацієнтів, які мали попередній клінічний діагноз ССА (за винятком 7 пацієнтів, яким діагноз було верифіковано за допомогою стандартного цитогенетичного методу). За допомогою FISH-методу вперше в Україні нами підтверджено клінічний діагноз у 18 осіб із 21 пацієнта з СВБ (86%), у 9 осіб із 19 пацієнтів з СПВ (47%) та у 13 осіб із 31 пацієнта з синдромом мікроделеції 22q11.2 (42%).

Застосування FISH-методу дозволило спростувати попередній клінічний діагноз у трьох із 21 пацієнта з СВБ (14%) і у 18 осіб із 31 обстеженого пацієнта з синдромом мікроделеції 22q11.2 (58%).  

 В зв’язку з тим, що до розвитку СПВ можуть призводити різні етіологічні чинники, а саме: делеція, мікроделеція в критичній ділянці, функціональна делеція або уніпарентна дисомія та мутація в центрі імпринтингу, навіть наявність двох сигналів локус-специфічного зонду у критичній ділянці 15q11.2-q13 не дозволила спростувати попередній клінічний діагноз. Тому, у 10 осіб із 19 пацієнтів з СПВ остаточний діагноз не було верифіковано (53%).

Отже, при дослідженні каріотипу 71 пацієнта з підозрою на ССА FISH-методом діагноз підтверджено у 40 пацієнтів (51,28%) та спростовано у 21 пацієнта (26,92%). Діагноз не верифіковано у 10 пробандів (12,82%). Таким чином рівень інформативності застосування молекулярно-цитогенетичного методу в нашому дослідженні склав 78,2%.

Важливо відзначити, що із 71 пацієнта для чотирьох (два пробанди з підозрою на СВБ та два пробанди з підозрою на синдром мікроделеції 22) діагноз підтверджено при молекулярно-цитогенетичному дослідженні на інтерфазних ядрах. Така необхідність виникла внаслідок низького мітотичного індексу у цих хворих. На сьогодні, інтерфазний метод посідає значне місце у виявленні ХП при проведенні пренатальної діагностики (Ворсанова, 2006). Наші дані показують, що цей метод може бути методом вибору при необхідності швидкої верифікації діагнозу ССА. Однак, після встановлення або спростування діагнозу на інтерфазних ядрах, обов’язковим є проведення стандартного цитогенетичного аналізу для перевірки наявності інших змін хромосомного набору, що і було нами вище показано.

В зв’язку з тим, що у 10 пацієнтів з попереднім клінічним діагнозом СПВ діагноз не верифіковано, ДНК пацієнтів та їхніх батьків було відправлено на молекулярний аналіз. В результаті проведення аналізу метилування ДНК та мікросателітного аналізу у трьох пацієнтів діагноз СПВ підтверджено, у двох – спростовано. Для 5-ти пацієнтів результати молекулярно-генетичного обстеження виявились не інформативними (6,4%).

Аналіз даних, отриманих при проведенні комплексного дослідження пацієнтів з підозрою на ССА із залученням стандартного та високочутливого цитогенетичних методів, FISH-аналізу та молекулярного аналізу показав, що процес підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу є складним та охоплює декілька етапів. Комплексне застосування цитогенетичних, молекулярно-цитогенетичних та молекулярних методів дозволило верифікувати діагноз у 93,6% пацієнтів з підозрою на ССА.

У відповідності з одержаними результатами, нами було створено загальний алгоритм лабораторного генетичного обстеження пацієнтів з підозроюна ССА (рис. 2) та розроблено диференційно-діагностичний підхід з цілеспрямованим використанням лабораторних генетичних методів для кожного нозологічного випадку.