Науковий центр радіаційної медицини амн україни

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ

ЄВСЕЄНКОВА ОЛЕНА ГЕННАДІЇВНА

УДК 575:577.21:576.316:616-076

 

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА

СИНДРОМІВ СЕГМЕНТНИХ АНЕУСОМІЙ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

Дисертації на здобуття наукового ступеня

Кандидата біологічних наук

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика (м.Київ), МОЗ України

 

Науковий керівник:

- доктор медичних наук, професор, член-кор. АМН України, Горовенко Наталія Григорівна, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л.Шупика, завідувач кафедри медичної генетики

Офіційні опоненти:

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Лукаш Любов Леонідівна, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділом генетики людини;

- доктор медичних наук, провідний науковий співробітник, Налєскіна Леся Анатоліївна, Інститут експериментальної патології, онкології, і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України провідний науковий співробітник відділу механізмів протипухлинної терапії

 

Захист відбудеться „20” березня 2008 року о  14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.02 в Науковому центрі радіаційної медицини АМН України (04050, м.Київ, вул. Мельникова, 53)

 

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Наукового центру радіаційної медицини АМН України (04050, м.Київ, вул. Мельникова, 53)

Автореферат розісланий „19” лютого 2008 р.

 

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради                     Г.В.Стефанович

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Було досліджено матеріал від 78 пацієнтів з попереднім клінічним діагнозом одного з ССА, а саме: СВХ – 3 пацієнта, синдром „котячого крику” – 1 пацієнт, СВБ – 21 пацієнт, ССМ – 2 пацієнта, СПВ – 19 пацієнтів, с-м мікроделеції 22q11.2 – 31 пацієнт, синдром „котячого ока” – 1 пацієнт. Вік пацієнтів коливався від 10 днів до 12 років. Також було досліджено матеріал від 6 батьків та 4 членів родин пробандів.

Матеріалом дослідження були лімфоцити периферичної крові осіб з різних регіонів України, у яких з 1998 по 2006 рік під час медико-генетичного консультування та/або знаходження на лікуванні було запідозрено ССА. Пацієнти проходили консультування на кафедрі медичної генетики НМАПО імені П.Л. Шупика, у медико-генетичному центрі УДСЛ „ОХМАТДИТ”, у медико-генетичному відділенні Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, Дитячої клінічної лікарні №1 та знаходилися на лікуванні у 3-му та 4-му хірургічних відділеннях Інституту серцево-судинної хірургії ім. М.М.Амосова АМНУ, у відділенні новонароджених Науково-практичного медичного центру дитячої кардіології та кардіохірургії МОЗ України. При виявленні у пробандів структурних перебудов хромосом досліджували каріотип їх батьків.

Для вирішення поставлених завдань у генетичній лабораторії кафедри медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика було отримано та проаналізовано препарати хромосом метафазної і прометафазної конденсації у 78 пацієнтів з підозрою на ССА та у 6 батьків і 4 членів родин. Для отримання хромосом метафазної конденсації до культуральної суміші PBmax (Gibco) додавали по 0,5 мл цільної крові пробанда (по 0,4 мл крові від новонародженої дитини). Культивування проводили за стандартною методикою (Hungerford et al., 1965).

Для отримання хромосом прометафазної конденсації додатково використовували метотрексат на 50-й годині культивування та 5-бром-дезоксиуридин на 67-й годині культивування (Зерова-Любимова, Горовенко, 2003). При дослідженні метафазних та прометафазних пластинок для ідентифікації хромосом та виявлення структурних перебудов використовували забарвлення за допомогою барвника Гімза на фосфатному буфері з рН 6,8 (GTG-метод) (Захаров и др., 1982) з попередньою обробкою трипсином. Метафазні та прометафазні пластинки для цитогенетичного аналізу відбирали за загальноприйнятими стандартами (Захаров и др., 1982; Зерова-Любимова, Горовенко, 2003).

Для проведення кількісної та якісної оцінки каріотипу хромосомні препарати після їхнього диференційного забарвлення аналізували за допомогою світлового мікроскопу ARISTOPLAN („Leica”) при збільшенні х1125. FISH-аналіз матеріалу від 71 пацієнта з підозрою на мікроструктурні зміни критичної ділянки досліджуваних хромосом 7, 15, 22 виконано у генетичній лабораторії кафедри медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика та, частково, в Інституті медичної генетики, Цюріх, Швейцарія, в межах спільного гранту (№7 IP 62652, 7 IP 051778). Препарати хромосом метафазної та прометафазної конденсації отримували за вищенаведеною методикою. Передгібридизаційну, гібридизаційну та післягібридизаційну обробку препаратів було проведено відповідно до стандартного протоколу, що рекомендовано фірмою-виробником ДНК-зондів. Для FISH-аналізу були використані локус-специфічні зонди.

Для ідентифікації мікроделецій в критичних ділянках хромосом 7q11.23, 15q11.2-q13, 22q11.2 отримані препарати аналізували за допомогою люмінесцентного мікроскопу Axioplan 2 (“Zeiss”), з 100-ватною люмінесцентною лампою та набором спеціальних фільтрів (DAPI/FITC/Rhodamine, “Zeiss”).

Запис результатів цитогенетичного аналізу та FISH-аналізу проводили згідно ISCN (1995, 2005).

ВИСНОВКИ

 

В дисертаційній роботі вперше запропоновано новий підхід щодо оптимізації генетичної діагностики ССА, який базується на визначенні інформативності стандартних та високочутливих цитогенетичних і молекулярно-цитогенетичного методів та створенні алгоритму генетичного обстеження пацієнтів з підозрою на ССА. Показно гетерогенність прояву кожного із досліджених синдромів як за клінічними, так і за цитогенетичними характеристиками, і необхідність застосування комплексу лабораторних генетичних підходів для підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу.

1. Доведено необхідність застосування стандартного цитогенетичного методу на першому етапі верифікації діагнозу ССА, який дозволив підтвердити попередній клінічний діагноз ССА у 8,97% пацієнтів, виявити інші хромосомні перебудови у 3,8% пацієнтів, встановити додатковий діагноз – синдром трисомії за довгим і, частково, коротким плечем хромосоми 12, який не відноситься до групи ССА. Встановлено батьківське походження дериватних хромосом у 33,3% випадків та обгрунтовано необхідність цитогенетичного аналізу у батьків при виявленні змін каріотипу у їхньої дитини.

2. Показано, що застосування високочутливого цитогенетичного методу дозволяє виявляти мікроделеції (3,8%) та конкретизувати результати стандартного цитогенетичного аналізу і точки розривів при структурних перебудовах хромосом.

3. Визначено високу специфічність FISH-методу для верифікації діагнозу ССА, застосування якого дозволило підтвердити попередній клінічний діагноз у 86% пацієнтів з синдромом Вільямса-Бойрена, у 47% – з синдромом Прадера-Віллі та 42% пацієнтів з синдромом мікроделеції 22q11.2; спростувати діагноз у 14% пацієнтів з синдромом Вільямса-Бойрена та 58% пацієнтів з синдромом мікроделеції 22q11.2, а також провести диференційну діагностику між синдромом Вільямса-Бойрена (МІМ 194050) та спадковим судинним захворюванням – ізольованим надклапанним стенозом аорти (МІМ 185500).

4. Вперше в Україні та вдруге в світі виявлено поєднання у одного пацієнта двох синдромів: синдрому мікроделеції 22q11.2 та синдрому трисомії за довгим і, частково, коротким плечем хромосоми 12. За допомогою поетапного застосування стандартного цитогенетичного методу та FISH-методу обгрунтовано доцільність одночасного використання обох методів при підозрі на ССА та виявленні інших структурних перебудов в каріотипі пробанда.

5. Встановлено високу інформативність FISH-аналізу із застосуванням локус-специфічних ДНК-зондів на інтерфазних ядрах при відсутності мітотичних хромосом на препаратах лімфоцитів периферичної крові (5,1%).

6. Визначено, що рівень інформативності застосування стандартного цитогенетичного та високочутливого цитогенетичного методів для підтвердження попереднього клінічного діагнозу синдромів: Вольфа-Хіршхорна, „котячого крику”, Сміта-Мадженіса та „котячого ока” склав 100%, синдрому мікроделеції 22q11.2 – 3,85%, в той же час як для синдромів Вільямса-Бойрена та Прадера-Віллі – 0%. Загальна інформативність цитогенетичних методів в нашому дослідженні склала 12,8%.

7. Встановлено, що загальна інформативність молекулярно-цитогенетичного методу для підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу ССА в нашому дослідженні склала 78,2%, що обґрунтовує доцільність використання FISH-аналізу для верифікації діагнозу синдромів з групи ССА.

8. Визначено, що застосування цитогенетичних, молекулярно-цитогенетичних та молекулярних методів дозволило верифікувати діагноз у 93,6% пацієнтів з підозрою на ССА, на підставі чого розроблено комплексний підхід щодо оптимізації індивідуалізованої діагностики кожного синдрому з групи ССА, який включає формування диференційно-діагностичних груп пацієнтів та створення алгоритму генетичного обстеження пробандів та їх родичів.  

 

Практичні рекомендації

 

Для лікарів-генетиків, неонатологів, педіатрів, кардіологів, кардіохірургів, дитячих неврологів, імунологів:

1. Направляти на цитогенетичний та молекулярно-цитогенетичний аналіз пацієнтів з характерними для синдромів з групи ССА вродженими вадами розвитку та вродженими вадами серця з метою підтвердження/спростування попереднього клінічного діагнозу.

2. Верифікацію діагнозу у дітей із підозрою на ССА доцільно проводити за запропонованим алгоритмом генетичного обстеження пацієнтів з даною патологією.

3. Виявлення у пробанда структурних перебудов хромосомного матеріалу за участю критичних ділянок хромосом 4, 5, 7, 15, 17, 22 або за участю інших хромосом є підставою для цитогенетичного дослідження лімфоцитів периферійної крові його батьків.

4. У всіх пацієнтів з надклапанним стенозом аорти рекомендовано проводити FISH-аналіз з метою підтвердження або спростування синдрому Вільямса-Бойрена.

5. Виявлення у плоду під час пренатального УЗД вад серця, що характерні для ССА обґрунтовує необхідність проведення пренатальної молекулярно-цитогенетичної діагностики плоду.

6. Наявність мікроделеції/мікродуплікації у пробанда є підставою для проведення пренатальної діагностики в родинах, що мають дитину з певним синдромом з групи ССА.

АНОТАЦІЯ

АНОТАЦИЯ

ANNOTATION

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ