Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Впровадження в практику клінічної цитогенетики високочутливих та молекулярно-цитогенетичних методів дало можливість визначити генетичні чинники понад 20 клінічно окреслених нозологічних форм хромосомної патології (ХП) та виділити їх в окрему групу захворювань – синдромів сегментних анеусомій (ССА), які супроводжуються мікроструктурними змінами ділянок певних хромосом (Кулешов, 2001; Иванов, 2004). До групи ССА зараховують синдром Вольфа-Хіршхорна (СВХ), синдром „котячого крику”, синдром Вільямса-Бойрена (СВБ), синдром Прадера-Віллі (СПВ), синдром мікроделеції 22q11.2, синдром „котячого ока” та інші. Більшість ССА зустрічаються рідко (1:50 000 – 1:100 000) (Бочков, 2001; Залетаев, 2001).

ССА є тяжкою патологією, яка обумовлює наявність множинних вроджених вад розвитку (МВВР), відставання хворих у розумовому, фізичному розвитку, зниження рівня життя та інвалідизацію у подальшому (Антоненко, 2001). Окрім того, однією з основних ознак ССА є наявність у пацієнтів вроджених вад серця (ВВС) різного ступеню важкості. Причому більшість пацієнтів з ССА та ВВС потребують кардіо-хірургічної корекції вже одразу після народження. В той же час ураження різних органів та систем, порушення імунної системи, що спричинені змінами в хромосомному наборі дитини при ССА, ускладнюють проведення кардіо-хірургічних втручань та перебіг післяопераційного періоду. Саме тому рання верифікація діагнозу ССА дозволяє передбачати та запобігати можливим ускладненням при оперативному лікуванні, що знижує показники смертності у пацієнтів з ССА, а також проводити адекватну медичну, психологічну допомогу та соціальну реабілітацію дітей з ССА (Сенаторова, 2006; Wernovsky, 2001).

Клінічна картина більшості ССА є досить чіткою, але, в той же час, варіабельною (Wernovsky, 2001). Так, при деяких синдромах з даної групи, окремі характерні клінічні ознаки можуть виявлятися як одразу після народження, так і через декілька років потому, на противагу певні характерні ознаки з часом зникають або стають менш виразними. Це не дає можливості встановити діагноз лише за клінічними ознаками та призводить як до гіподіагностики, так і до гіпердіагностики синдрому з групи ССА. При ССА має місце і цитогенетична варіабельність, яка пов’язана з різною довжиною делеції або дуплікації певних ділянок хромосом, а також з різним батьківським походженням мікроперебудов, які і призводять до розвитку певних клінічних ознак синдрому (Бочков, 2001; Пішак, 2004; Morris et al., 2003). Тому швидкість та якість підтвердження діагнозу залежить від чутливості та специфічності застосованих методів. Так, деякі пацієнти з ССА мають значну за розміром делецію/дуплікацію, яку видно у світловий мікроскоп, хоча, у більшості випадків каріотип пацієнтів з підозрою на ССА відповідає нормі. У зв’язку з цим для остаточного підтвердження діагнозу ССА необхідним є використання молекулярно-цитогенетичних технологій, а саме методу флуоресцентної in situ гібридизації (FISH), який є одним із найбільш високоспецифічих методів діагностики ХП в сучасній цитогенетиці (Юров, 2000). В Україні молекулярно-цитогенетичне підтвердження/спростування діагнозу ССА досі не проводили, а верифікація діагнозу ССА базувалася лише на клінічному досвіді лікарів.

Маловивченим залишається питання про етапність та доцільність застосування стандартного та високочутливого цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів для верифікації ССА, кожен з яких є високовартісним та потребує спеціальної підготовки висококваліфікованого персоналу. У зв’язку з цим актуальним є визначення рівня інформативності цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичних методів та послідовності їхнього застосування для підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу ССА.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках тематичного плану Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика „Визначення ролі ендогенних та екзогенних факторів у виникненні та перебігу генної та хромосомної патології на різних етапах онтогенезу” (номер держреєстрації 0101U000231, 2001–2005 рр.) та спільного гранту між НМАПО імені П.Л.Шупика, Київ, Україна та Інститутом медичної генетики, Цюріх, Швейцарія (№7 IP 62652, 7 IP 051778).

Мета роботи – визначити інформативність використання цитогенетичних і молекулярно-цитогенетичного методів при верифікації діагнозу у пацієнтів з підозрою на синдроми сегментних анеусомій та створити алгоритм для оптимізації лабораторного етапу їх генетичного обстеження.

Задачі дослідження:

1. Дослідити каріотип хворих із підозрою на ССА за допомогою стандартного та високочутливого цитогенетичних методів діагностики.

2. Провести молекулярно-цитогенетичний аналіз хромосомних препаратів у осіб з підозрою на ССА, в каріотипі яких не було виявлено змін у критичних ділянках досліджуваних хромосом 4, 5, 7, 15, 17, 22 при застосуванні стандартного цитогенетичного методу.

3. Визначити рівень інформативності застосування цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів для підтвердження/спростування окремих клінічних діагнозів у пацієнтів з підозрою на ССА.

4. Охарактеризувати диференційно-діагностичний підхід з цілеспрямованим використанням цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів для підтвердження/спростування попереднього клінічного діагнозу при ССА.

5. Розробити алгоритм генетичного обстеження дітей з ССА для оптимізації лабораторного етапу діагностування цієї патології.

Об’єкт дослідження – синдроми сегментних анеусомій (синдром Вольфа-Хіршхорна, синдром „котячого крику”, синдром Вільямса-Бойрена, синдром Прадера-Віллі, синдром Сміта-Мадженіса, синдром мікроделеції 22q11.2, синдром „котячого ока”).

Предмет дослідження – метафазні, прометафазні хромосоми та інтерфазні ядра лімфоцитів периферичної крові пацієнтів з підозрою на ССА, мікроделеції критичних ділянок хромосом 4, 5, 7, 15, 17, 22.

Методи дослідження –стандартний цитогенетичний метод, високочутливий цитогенетичний метод, молекулярно-цитогенетичний метод (FISH).

Наукова новизна одержаних результатів. Систематизовано структурні та мікроструктурні зміни у критичних ділянках хромосом 4, 5, 7, 15, 17, 22 у пацієнтів з ССА та визначено рівень інформативностіметодів, що були використані для виявлення цих порушень. Вперше в Україні та вдруге в світі визначено поєднання у одного пацієнта двох наступних синдромів: синдрому трисомії довгого і, частково, короткого плеча хромосоми 12 з синдромом мікроделеції 22q11.2 (каріотип 46,XX,der(12)t(12;22)(q13.2;q11.2)mat,-22). Доведено необхідність використання стандартного цитогенетичного методу як першого етапу діагностики у всіх випадках верифікації діагнозу при підозрі на ССА. Встановлено, що використання FISH-методу дає можливість проводити диференційну діагностику між спадковим судинним захворюванням – ізольованим надклапанним стенозом аорти (MIM 185500) та СВБ (МІМ 194050). Вперше запропоновано диференційно-діагностичний підхід для підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу ССА з цілеспрямованим застосуванням цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів дослідження.

Практичне значення одержаних результатів. Показано межі застосування стандартного і високочутливого цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів діагностики ХП для підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу ССА. Розроблено диференційований підхід до використання цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів у вигляді алгоритму, що дає можливість визначити етапність генетичного обстеження пацієнта з підозрою на ССА. Доведено, що використання алгоритму генетичного обстеження пацієнтів з попереднім клінічним діагнозом ССА сприяє оптимізації верифікації діагнозу та покращує ефективність подальшої медико-генетичної допомоги в родині. Застосування FISH–методу дозволяє високоспецифічно проводити диференційну діагностику двох різних генетичних захворювань – СВБ та моногенного ізольованого надклапанного стенозу аорти та, відповідно, підвищити точність медико-генетичного консультування. Виявлення випадків структурних перебудов в каріотипі батьків, які спричинили розвиток ССА у їхніх дітей, обґрунтовує необхідність проведення пренатальної діагностики в таких родинах. За матеріалами дослідження підготовлено та видано дві методичні рекомендації та інформаційний листок. Результати роботи впроваджено в практику хірургічних відділень Інституту серцево-судинної хірургії імені М.М.Амосова АМН України, Дитячої обласної клінічної лікарні та Обласної медико-генетичної консультації м.Івано-Франківська, медико-генетичної консультації Рівненського обласного клінічного лікувально–діагностичного центру ім. В.Поліщука та у навчальний процес на кафедрі медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика.

Особистий внесок здобувача. Дисертант проаналізувала літературні джерела за обраною темою. Автором особисто було отримано та проаналізовано первинні матеріали дисертаційного дослідження, а саме: було проведено цитогенетичне дослідження з аналізом хромосомних препаратів лімфоцитів периферичної крові пацієнтів із підозрою на ССА і, вибірково, членів їхніх родин та молекулярно-цитогенетичне дослідження з аналізом отриманих препаратів пацієнтів з підозрою на ССА. Дисертантом було проаналізовано отримані дані, підготовлено публікації до друку. Самостійно написано та оформлено всі розділи дисертаційної роботи. Автор щиро вдячна професору Альберту Шинцелю (Інститут медичної генетики, Цюріх, Швейцарія) за допомогу в проведенні молекулярно-генетичної діагностики у частини пацієнтів з функціональною делецією хромосоми 15 при СПВ.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на І Всеросійському конгресі „Современные технологии в педиатрии и детской хирургии” (Москва, 2002), I Українському конгресі з клінічної генетики з міжнародною участю „Метаболічні спадкові захворювання” (Харків, 2003), 14^th European Students’ Conference (Berlin, 2003), Науково-практичній конференції з міжнародною участю „Сучасні лабораторні методи дослідження спадкової патології” (Київ, 2004), Науковій конференції „Сучасна біотехнологія в сільському господарстві та медицині” (Київ, 2005), 7^th Balkan Meeting on Human Genetics (Skopje, Republic of Macedonia, 2006), Second Eastern European Conference on Rare Diseases and Orfan Drugs “Fostering research on rare diseases in eastern european countries” (Plovdiv, Bulgaria, 2006), П’ятому Російському конгресі „Современные технологии в педиатрии и детской хирургии” (Москва, 2006), VIII Всеукраїнській науково-практичній конференції „Актуальні питання педіатрії” (Київ, 2006), на науково-практичній конференції з міжнародною участю „Актуальні питання медичної генетики” (Київ, 2007), XI Ювілейному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2007), на Всеукраїнській науково-практичній конференції „Сучасні методичні підходи до аналізу здоров’я” (Луганськ, 2007), на конференції з медичної генетики з міжнародною участю „Плід – як частина родини” (Харків, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 друкованих праць, серед них: 3 статті у виданнях, затверджених ВАК України, 1 стаття – у закордонному журналі, 2 статті у збірниках наукових праць, 10 тез, опублікованих у матеріалах з’їздів, симпозіумів та конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 129 сторінках машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, що включає описання матеріалів та методів, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел. Дисертація містить 14 таблиць та 11 рисунків. Список використаних джерел охоплює 182 найменування, з них 50 – кирилицею та 132 роботи латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Було досліджено матеріал від 78 пацієнтів з попереднім клінічним діагнозом одного з ССА, а саме: СВХ – 3 пацієнта, синдром „котячого крику” – 1 пацієнт, СВБ – 21 пацієнт, ССМ – 2 пацієнта, СПВ – 19 пацієнтів, с-м мікроделеції 22q11.2 – 31 пацієнт, синдром „котячого ока” – 1 пацієнт. Вік пацієнтів коливався від 10 днів до 12 років. Також було досліджено матеріал від 6 батьків та 4 членів родин пробандів.

Матеріалом дослідження були лімфоцити периферичної крові осіб з різних регіонів України, у яких з 1998 по 2006 рік під час медико-генетичного консультування та/або знаходження на лікуванні було запідозрено ССА. Пацієнти проходили консультування на кафедрі медичної генетики НМАПО імені П.Л. Шупика, у медико-генетичному центрі УДСЛ „ОХМАТДИТ”, у медико-генетичному відділенні Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, Дитячої клінічної лікарні №1 та знаходилися на лікуванні у 3-му та 4-му хірургічних відділеннях Інституту серцево-судинної хірургії ім. М.М.Амосова АМНУ, у відділенні новонароджених Науково-практичного медичного центру дитячої кардіології та кардіохірургії МОЗ України. При виявленні у пробандів структурних перебудов хромосом досліджували каріотип їх батьків.

Для вирішення поставлених завдань у генетичній лабораторії кафедри медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика було отримано та проаналізовано препарати хромосом метафазної і прометафазної конденсації у 78 пацієнтів з підозрою на ССА та у 6 батьків і 4 членів родин. Для отримання хромосом метафазної конденсації до культуральної суміші PBmax (Gibco) додавали по 0,5 мл цільної крові пробанда (по 0,4 мл крові від новонародженої дитини). Культивування проводили за стандартною методикою (Hungerford et al., 1965).

Для отримання хромосом прометафазної конденсації додатково використовували метотрексат на 50-й годині культивування та 5-бром-дезоксиуридин на 67-й годині культивування (Зерова-Любимова, Горовенко, 2003). При дослідженні метафазних та прометафазних пластинок для ідентифікації хромосом та виявлення структурних перебудов використовували забарвлення за допомогою барвника Гімза на фосфатному буфері з рН 6,8 (GTG-метод) (Захаров и др., 1982) з попередньою обробкою трипсином. Метафазні та прометафазні пластинки для цитогенетичного аналізу відбирали за загальноприйнятими стандартами (Захаров и др., 1982; Зерова-Любимова, Горовенко, 2003).

Для проведення кількісної та якісної оцінки каріотипу хромосомні препарати після їхнього диференційного забарвлення аналізували за допомогою світлового мікроскопу ARISTOPLAN („Leica”) при збільшенні х1125. FISH-аналіз матеріалу від 71 пацієнта з підозрою на мікроструктурні зміни критичної ділянки досліджуваних хромосом 7, 15, 22 виконано у генетичній лабораторії кафедри медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика та, частково, в Інституті медичної генетики, Цюріх, Швейцарія, в межах спільного гранту (№7 IP 62652, 7 IP 051778). Препарати хромосом метафазної та прометафазної конденсації отримували за вищенаведеною методикою. Передгібридизаційну, гібридизаційну та післягібридизаційну обробку препаратів було проведено відповідно до стандартного протоколу, що рекомендовано фірмою-виробником ДНК-зондів. Для FISH-аналізу були використані локус-специфічні зонди.

Для ідентифікації мікроделецій в критичних ділянках хромосом 7q11.23, 15q11.2-q13, 22q11.2 отримані препарати аналізували за допомогою люмінесцентного мікроскопу Axioplan 2 (“Zeiss”), з 100-ватною люмінесцентною лампою та набором спеціальних фільтрів (DAPI/FITC/Rhodamine, “Zeiss”).

Запис результатів цитогенетичного аналізу та FISH-аналізу проводили згідно ISCN (1995, 2005).