Основные направления развития современной микробиологии. Методы микробиологических исследований. Чистые культуры прокариот. Основные параметры и закономерности роста культур.

Как общая М., так и её специальные разделы развиваются исключительно бурно. Существуют три основных причины такого развития. Во-первых, благодаря успехам физики, химии и техники М. получила большое число новых методов исследования. Во-вторых, начиная с 40-х гг. 20 в. резко возросло практическое применение микроорганизмов. В-третьих, микроорганизмы стали использовать для решения важнейших биологических проблем, таких, как наследственность и изменчивость, биосинтез органических соединений, регуляция обмена веществ и др. Для получения бесклеточных ферментных систем и фракций, содержащих определённые внутриклеточные структуры, применяют аппараты, разрушающие клетки микроорганизмов, а также градиентное центрифугирование, позволяющее получать частицы клеток, обладающие различной массой. Для исследования морфологии и цитологии микроорганизмов разработаны новые виды микроскопической техники.    Для изучения обмена веществ и химического состава микроорганизмов получили распространение различные способы хроматографии, масс-спектрометрия, метод изотопных индикаторов, электрофорез и др. физические и физико-химические методы. Для обнаружения органических соединений применяют также чистые препараты ферментов. Предложены новые способы выделения и химической очистки продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (адсорбция и хроматография на ионообменных смолах, а также иммунохимические методы, основанные на специфической адсорбции определённого продукта, например фермента, антителами животного, образовавшимися у него после введения этого вещества). Сочетание цитологических и биохимических методов исследования привело к возникновению функциональной морфологии микроорганизмов. С помощью электронного микроскопа стало возможным изучение тонких особенностей строения цитоплазматических мембран и рибосом, их состава и функций (например, роль цитоплазматических мембран в процессах транспорта различных веществ или участие рибосом в биосинтезе белка).    Лаборатории обогатились ферментерами различной ёмкости и конструкции. Широкое распространение получило непрерывное культивирование микроорганизмов, основанное на постоянном притоке свежей питательной среды и оттоке жидкой культуры.

Методы микробиологических исследований. Микроскопия— изучение объектов с использованием микроскопа. Подразделяется на несколько видов: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, многофотонная микроскопия, рентгеновская микроскопия, рентгеновская лазерная микроскопия и предназначается для наблюдения и регистрации увеличенных изображений образца.

Методы выделения чистых культур м/организмов основаны на изоляции одной микробной клетки от массы м/организмов и последующем выращивании потомства этой клетки на питательных средах изолированно от других видов.

Наиболее распространенным способом выделения чистых культур является посев смеси микробов на плотные питательные смеси с целью получения отдельных колоний культур, которые считают результатом развития одной клетки. Для посева чаще используют агаризованные среды в чашках Петри. Основной задачей метода является разведении концентрации м/организмов в исследуемом материале с таким расчетом, чтобы при посеве его на питательную среду выросли изолированные колонии.

Культивирование (ферментация) - это процесс, во время которого микроорганизмы растут (увеличивают свою численность) и превращают компоненты питательной среды в целевой продукт. В качестве микроорганизмов могут использоваться дрожжи, грибы или бактерии. В том случае, когда в качестве организмов-продуцентов используются клетки животных или гибридомы, говорят о культуре клеток. Одно из требований к процессу культивирования состоит в обеспечении микроорганизмов или культуры клеток условиями, благоприятными для их оптимального роста и образования продукта. Это требование реализуется с помощью биореактора (ферментера).

Чистая культура-совокупность микробов одного вида или варианта, полученная из одного образца материала и содержащаяся в определенном объеме среды (напр., в пробирке). Ч.к. из колонии обладает высокой однородностью св-в, поскольку она обычно происходит из одной особи. Ч.к., полученная путем селективной обработки материала, содержащего смесь микробов, менее однородна.

Под ростом бактерий понимают увеличение массы клеток без изменения их числа в популяции как результат скоординированного воспроизведения всех клеточных компонентов и структур. Увеличение числа клеток в популяции микроорганизмов обозначают термином «размножение». Оно характеризуется временем генерации (интервал времени, за который число клеток удваивается) и таким понятием, как концентрация бактерий (число клеток в 1 мл). При внесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получим так называемую периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве). При изучении процесса размножения бактерий необходимо учитывать, что бактерии всегда существуют в виде более или менее многочисленных популяций, и развитие бактериальной популяции в жидкой питательной среде в периодической культуре можно рассматривать как замкнутую систему. Зависимость концентрации жизнеспособных клеток при периодическом культивировании от длительности инкубирования описывается характерной кривой, которая имеет S-образную форму (рис. 1). На кривой можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности: лаг-фазу; логарифмическую фазу; стационарную фазу; фазу отмирания.

 • 1-я — начальная— характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой;

 • 2-я — логарифмическая— характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и значительным увеличением числа клеток в популяции;

 • 3-я — стационарная фаза — наступает тогда, когда число клеток в популяции перестает увеличиваться. Это связано с тем, что наступает равновесие между числом вновь образующихся и гибнущих клеток.

• 4-я — фаза отмирания — характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции. Прекращение роста численности (размножения) популяции микроорганизмов наступает в связи с истощением питательной среды и/или накоплением в ней продуктов метаболизма микробных клеток.

В условиях сбалансированного роста легко определить величину скорости роста бактериальной популяции в каждый момент времени, если измерить прирост любого компонента клетки по отношению к его исходному количеству. Таким образом, в культуре, растущей сбалансированно, скорость прироста вещества клеток в любой данный момент пропорциональна числу или массе имеющихся в это время бактерий. Коэффициент пропорциональности называют удельной скоростью роста (µ).

Данная величина отличается для разных культур. Даже для одной куль-

туры в зависимости от условий выращивания она меняется. Удельную скорость роста можно рассчитать по следующим формулам:

 

и ;

где N – число клеток в единице объема; Х – масса клеток в единице объема; t – время.

Зная удельную скорость роста, можно определить время генерации (g – время, необходимое для удвоения числа клеток популяции в часах или минутах):

.

Масса клеток, образованная на единицу использованного компонента среды, представляет собой величину, которую называют экономическим коэффициентом (или выходом биомассы).