ГАМКергическая синаптическая передача

ГАМК (γ-аминомасляная кислота), основной тормозный нейропередатчик в ЦНС, синтезируется при декарбоксилировании глутамата. Существует две изоформы декарбоксилазы (GAD67 и GAD65). GAD67 распространена по всей цитоплазме, а GAD65 в основном находится в пресинаптических терминалях ГАМКергических интернейронов. Экспрессия этого фермента меняется в зависимости от активности нейрона, указывая на то, что он играет определенную роль в регуляции ГАМКергической передачи (Soghomonian and Martin 1998). Молекулы нейропередатчика в пресинаптическом участке переносятся из цитоплазмы в везикулы с помощью специальных транспортеров, которые используют протонный градиент, создаваемый везикулярными АТФазами. Интересно отметить, что механизмы везикулярного захвата возбуждающего медиатора (глутамата) и тормозного (ГАМК) принципиально различны. Анионы глутамата непосредственно движутся в везикулы по градиенту, сформированному высокой концентрацией H⁺ в везикулах. В случае ГАМК, по протонному градиенту движутся сначала анионы Cl^-, которые затем обмениваются на анионы ГАМК (Fykse and Fonnum 1996). Белок, участвующий в поглощении глутамата везикулами, был недавно обнаружен (Bellocchio et al. 2000; Takamori et al. 2000), тогда как белок, опосредующий обмен Cl^- на ГАМК^-, остается неизвестным. Известно только, что захват ГАМК в везикулы происходит при вспомогательной роли фермента VGAT1, который также участвует везикулярном транспорте глицина. Тем не менее, этот фермент не является абсолютно необходимым для упаковки ГАМК в везикулы, поскольку отсутствует в ряде ГАМКергических терминалей (Chaudhry et al. 1998).

После того как ГАМК высвобождается в синаптическую щель, начинается ее захват электрогенными транспортерами. В настоящее время известно три таких транспортера: GAT1, GAT2 и GAT3 (Schousboe 2000). Эти транспортеры расположены как в астроцитах, так и в самих нейронах. Поскольку транспорт является электрогенным, анион аминокислоты переносится вместе с двумя катионами Na⁺ (и, видимо, одним анионом Cl^-) (Cammack et al. 1994; Kavanaugh et al. 1992). Различные типы транспортеров обладают клеткоспецифичной локализацией. Например, GAT1 практически отсутствует в нейронах, в отличие от GAT3.

ГАМКергические рецепторы

ГАМК действует на две основные группы рецепторов - ионотропные ГАМК_А/ГАМК_С (Рис.1.1) и метаботропные ГАМК_В рецепторы (Bormann 2000a). В настоящее время правомерность деления ионотропных рецепторов на два типа А и С активно дискутируется. В данном обзоре литературы для сохранения объективности рассмотрение типов ГАМКергических рецепторов проводится в алфавитном порядке “ABC”.

 

 

 

 

Рис. 1.1 Фармакологические характеристики ионотропных ГАМКергических рецепторов

а, Схема ГАМК_А рецептора, на которой показаны агонисты: ГАМК, изогувазин; конкурентный антагонист бикукуллин, действующий на сайт связывания агонистов. Показаны сайты аллостерических модуляторов: бензодиазепинов и барбитуратов. Неконкурентный антагонист пикротоксин действует на участок внутри канала ГАМК_А рецепторов. б, схема ГАМК_С рецептора, на которой показаны агонисты: ГАМК, CACA; конкурентный антагонист TPMPA, действующий на сайт связывания агонистов. Сайты аллостерических модуляторов отсутствуют. Пикротоксин также является неконкурентным антагонистом ГАМК_С рецепторов, хотя и менее эффективным, чем ГАМК_А.

 

 

ГАМК_А

ГАМК_А рецепторы у млекопитающих состоят из, как минимум, 16 субъединиц, которые сгруппированы в семь классов: α, β, γ, δ, ε, π и σ (Costa 1998; Mehta and Ticku 1999). Комбинации этих субъединиц дают множество изоформ рецепторов. Причем композиция субъединиц определяет специфичность эффектов аллостерических модуляторов ГАМК_А рецепторов, таких как нейростероиды, цинк, бензодиазепины и барбитураты (Mehta and Ticku 1999). Композиция субъединиц также определяет кинетику активации рецепторов и может оказывать влияние на их десенситизацию (Bianchi et al. 2001). Интересно, что наличие тех или иных субъединиц в ГАМКергическом рецепторе зависит и от его локализации. Так, например, α₂ субъединица находится исключительно в сомато-дендритных синапсах, но не в тормозных синапсах на начальном сегменте аксона (Nusser et al. 1996). Наконец, композиция субъединиц ГАМК_А рецепторов может меняться в нейронах во время эпилептогенеза и эти изменения отражаются в фармакодинамике лекарственных препаратов (Brooks-Kayal et al. 1998).

Из 16 субъединиц ГАМК_А рецепторов только 10 экспрессируются в достаточном количестве гиппокампе (Sperk et al. 1997). Этого вполне хватает, чтобы создать значительную гетерогенность ГАМКергических рецепторов в различных участках данной структуры. Считается, что типичные гиппокампальные рецепторы содержат одну-две α субъединицы и одну-две β. Поскольку рецептор состоит из 5 субъединиц, то в дополнение к ним присоединяются одна-две либо γ, либо δ субъединицы (предполагается, что вместе γ и δ субъединицы не входят в состав одного рецептора). Наличие γ субъединицы влияет на разные параметры ГАМКергического рецептора. В частности, γ субъединица взаимодействует с гефирином, цитоскелетным белком, играющим важную роль в "заякоривании" ГАМКергических рецепторов в синаптической щели (Essrich et al. 1998). ГАМКергические рецепторы, содержащие δ субъединицу, преимущественно располагаются вне синапса. Значение синаптических и внесинаптических рецепторов ГАМК будет обсуждено далее (см. раздел 1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического торможения).

В синаптическом ответе ГАМК_А рецепторы определяют быстрый компонент тока. Канал ГАМК_А рецептора проницаем для ионов хлора и, в некоторой степени, для бикарбоната. Поэтому эффект активации данных рецепторов будет зависеть от электрохимического градиента для вышеуказанных ионов на постсинаптической мембране (Macdonald and Olsen 1994). В нервной системе взрослых животных внеклеточная концентрация ионов хлора выше внутриклеточной, что приводит к более негативному потенциалу реверсии для хлорного тока, чем потенциал покоя клеток. Таким образом, активация ГАМК_А рецепторов приводит к входу ионов Сl^- в нейрон и к гиперполяризации клетки. Необходимый градиент ионов хлора поддерживается калий/хлор котранспортером KCC2 (Rivera et al. 1999), который начинает выкачивать Сl^- наружу после синаптического события. Отсутствие данного транспортера в незрелых гиппокампальных нейронах определяет относительно высокую внутриклеточную концентрацию ионов хлора, что ведет к более позитивному потенциалу реверсии для этого аниона, чем потенциал покоя клеток. В этом случае, активация ГАМК_А рецепторов приводит к деполяризации нейронов (Ben-Ari et al. 1994; Ganguly et al. 2001; Rivera et al. 1999). Однако, и во взрослом мозге, в котором ГАМК_А рецепторы являются гиперполяризующими, продолжительная активация ГАМКергических терминалей может привести к длительному деполяризующему потенциалу (Jackson et al. 1999a). Этот потенциал частично опосредуется внеклеточным накоплением калия, высвобожденного при активации KCC2 (Smirnov et al. 1999).

Аллостерические модуляторы ГАМК_А рецепторов

В ГАМК_А рецепторе (Рис.1.1) существует целый ряд модуляторных сайтов, отличных от сайта связывания агониста. Вещества, воздействующие на данные сайты, повышают или, наоборот, снижают эффективность активации ГАМК_А рецепторов агонистом (Johnston 1996). Одним из таких сайтов аллостерических модуляторов является бензодиазепиновый сайт. Этот сайт представляет собой мишень для ряда препаратов, используемых в клинической практике: антиконвульсантов, седативных и гипнотических средств. Активация бензодиазепинового сайта ведет к увеличению аффинности к агонисту у определенной группы, но не всех, ГАМК_А рецепторов. Было показано, что токи, опосредованные низкоаффинными ГАМКергическими рецепторами, в гиппокампе усиливаются бензодиазепинами в гораздо большей степени, чем опосредованные высокоаффинными рецепторами (Schonrock and Bormann 1993). Различия ГАМКергических рецепторов по их чувствительности к бензодиазепинам, могут быть объяснены также различным составом входящих в них субъединиц. Это подтверждается тем, что диазепам приводит к увеличению величины ГАМКергического тока лишь при наличии γ₂ субъединицы в ГАМК_А рецепторах (Pritchett et al. 1989). Другим сайтом, аллостерической модуляции ГАМК_А рецепторов является сайт барбитуратов (Рис. 1.1). ГАМК_А рецепторы, чувствительные к барбитуратам более широко распространены в мозге, чем чувствительные к бензодиазепинам (Johnston 1996). В отличие от бензодиазепинов, увеличивающих аффинность ГАМКергического рецептора к агонисту, барбитураты увеличивают время открытого состояния и проводимость каналов ГАМКергического рецептора (Eghbali et al. 2000). Барбитураты также, как и бензодиазепины, используются в качестве антиэпилептических и седативных веществ. Сверхдозы пентобарбитала применяются для эфтаназии.

Кроме бензодиазепинов и барбитуратов специфичным модулирующим действием на ГАМК_А рецепторы обладают нейростероиды и цинк (Mehta and Ticku 1999).

ГАМК_В

Метаботропные ГАМК_В рецепторы представляют собой гетеродимеры (Mohler and Fritschy 1999), состоящие из двух субъединиц: GBR₁ и GBR₂ (Jones et al. 1998). Эти две субъединицы возникают благодаря альтернативному сплайсингу (Kuner et al. 1999). Определено, что ГАМК_В рецепторы находятся как пре-, так и постсинаптически (Couve et al. 2000; Mott and Lewis 1994). Тем не менее, достаточно мало известно об их субклеточном распространении (Fritschy et al. 1999). Другими словами, не вполне понятно, группируются ли, например, постсинаптические ГАМК_В рецепторы в синаптической щели напротив места выброса ГАМК или расположены на удалении от синапса. Постсинаптическим эффектом активации данных рецепторов является длительная гиперполяризация, следующая за быстрым ионотропным компонентом ГАМКергической передачи. В своем недавнем исследовании Scanziani (Scanziani 2000) приводит аргументы в пользу того, что ГАМК_В рецепторы расположены далеко от места выброса медиатора и активируются ГАМК, покидающей синаптическую щель (спилловер ГАМК). При этом он считает, что для достижения достаточной для активации данных рецепторов внеклеточной концентрации ГАМК необходима одновременная активация нескольких ГАМКергических синапсов.

Не до конца понятно субклеточное распределение и пресинаптических ГАМК_В рецепторов. Не ясно расположены ли эти рецепторы в перисинаптической области или они далеко от активной зоны. Пресинаптический эффект ГАМК_В рецепторов заключается в том, что они снижают как высвобождение ГАМК в тормозных синапсах, так и высвобождение глутамата в возбуждающих (Mott and Lewis 1994).

ГАМК_В рецепторы связаны с тримерным G-белком (Hill et al. 1984). Одним из эффектов их активации является ингибирование аденилатциклазы (Nishikawa et al. 1997). Кроме того, данные рецепторы прямо связаны через G-белок с N и P/Q типами потенциал зависимых кальциевых каналов, которые участвуют в синаптическом высвобождении нейропередатчиков (Anwyl 1991; Mintz and Bean 1993). Таким образом, пресинаптические ГАМК_В рецепторы снижают высвобождение нейропередатчиков уменьшая пресинаптический вход кальция. Наконец, на постсинаптическом участке ГАМК_В рецепторы запускают каскад реакций, который ведет к открыванию G-белок связанных К⁺ каналов (GIRK – G protein-gated inward rectifying K⁺ channels) (Andrade et al. 1986; Misgeld et al. 1995). Благодаря активации этих каналов и возникает медленный ТПСТ, длящийся сотни миллисекунд (Scanziani 2000). По этой причине его легко отличить от ТПСТ, опосредованного ГАМК_А рецепторами. Медленный ТПСТ, опосредованный ГАМК_В рецепторами, будет характеризоваться длительной кинетикой и потенциалом реверсии отличным от E_Cl-.

ГАМК_С

ГАМК_С рецепторы могли бы считаться филогенетически самым старым типом ионотропных ГАМКергических рецепторов (Bormann and Feigenspan 1995). Этот тип объединяет гомомерные рецепторы, состоящие только из ρ-субъединиц, которые в свою очередь делятся на 3 класса: ρ₁, ρ₂ и ρ₃ (Zhang et al. 2001). Данные субъединицы в наибольшем колличестве сосредоточены в ретине позвоночных, хотя обнаружены и в других структурах ЦНС, в частности, гиппокампе (Enz et al. 1995; Enz and Cutting 1999; Ogurusu et al. 1999; Wegelius et al. 1998). Считается, что ρ-субъединицы не образуют гетеромерных рецепторов с другими субъединицами (Hackam et al. 1998; Koulen et al. 1998). Тем не менее, недавно и была продемонстрирована возможность создания гетеромера из ρ и γ₂ субъединиц в ооцитах Xenopus (Qian and Ripps 1999).

Поскольку композиция субъединиц играет ключевую роль в фармакологических свойствах ГАМКергических рецепторов, ГАМК_С рецепторы имеют отличный от ГАМК_А рецепторов фармакологический профиль. Они не чувствительны к бикукуллину, аллостерическим модуляторам и специфическим агонистам ГАМК_А рецепторов. С другой стороны, существуют специфические агонисты и антагонисты этих рецепторов, неактивные для ГАМК_А (основные различия типов рецепторов представлены на Рис.1.1) (Bormann 2000a). Тем не менее, комитет IUPHAR не рекомендовал вводить ГАМК_С рецепторы в классификацию как отдельный тип (Barnard et al. 1998). Он предложил считать эти рецепторы специфическим классом ρ-содержащих ГАМК_А рецепторов. Основные аргументы обходили тот факт, что эти рецепторы имеют отличную фармакологию, структуру, функцию и клеточную локализацию. Вместо этого они делали акцент на том, что выделение ГАМК_С рецепторов как отдельного типа создает возможность для дальнейшего расширения классификации и разрушения удобной системы ГАМК_А/ГАМК_В (ионотропные/метаботропные рецепторы). Поступило, например, предложение ввести новый ГАМК_D тип рецепторов. В эмбриональной ткани цыплят были обнаружены ГАМКергические рецепторы, которые не были чувствительны к антагонистам ни ГАМК_А, ни ГАМК_В рецепторов, но активировались агонистами и ГАМК_А, и ГАМК_В (Momose-Sato et al. 1997). Поступило также предложение “ГАМК_D” рецептора с отличной ионной селективностью канала (Perkins and Wong 1996).

Надо отметить, что идея объединения ионотропных ГАМКергических рецепторов в один тип нашла как своих сторонников, так и своих противников (Bormann 2000a; Zhang et al. 2001). Таким образом, современная классификация ГАМКергических рецепторов еще не окончательно сформирована и требует дополнительных экспериментальных исследований, направленных на поиск сходств и различий между ГАМК_А и ГАМК_С рецепторами.

В заключение можно заметить, что если принять простое деление ГАМКергических рецепторов на ионотропные и метаботропные – ГАМК_А/ГАМК_В, различные комбинации субъединиц ионотропных ГАМКергических рецепторов позволяют существовать целому ряду фармакологически и функционально различных типов торможения. Исходя из этого, одной из задач данной диссертационной работы было определение фармакологического и биофизического профиля гиппокампальных ГАМКергических рецепторов. Мы решили исследовать особенности ГАМКергических рецепторов, принимающих участие в торможении между двумя интернейронами и интернейроном и пирамидной клеткой, и оценить какую это может играть функциональную роль.