Доктор биологических наук О.В.Годухин

Доктор биологических наук О.В.Годухин

Профессор D.M. Kullmann

 

 

Лондон – Пущино

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ.. 1

Сокращения и глоссарий. 6

Введение.. 10

1 Обзор литературы... 17

1.1 Торможение в гиппокампе. 17

1.1.1 ГАМКергическая синаптическая передача. 17

1.1.2 ГАМКергические рецепторы.. 19

1.1.3 Разнообразие форм торможения. 26

1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического торможения. 28

1.2 Взаимодействие между глутамат и ГАМКергической системами. 34

1.2.1 Гетеросинаптические взаимодействия. 35

1.2.2 Критерии гетеросинаптической депрессии. 38

1.2.3 Метаботропные рецепторы группы III в гиппокампе. 39

1.2.4 Каинатные рецепторы в гиппокампе. 41

1.3 Механизмы фокального эпилептогенеза. 45

1.3.1 Исследования эпилептогенеза. 45

1.3.2 Критерии развития эпилептиформной активности. 48

1.3.3 Возбуждающие механизмы в эпилептогенезе. 51

1.3.4 Тормозные механизмы в эпилептогенезе. 52

1.4 Постановка цели и задач исследования. 55

2. Материалы и методы... 57

2.1 Срезы гиппокампа. 57

2.1.1 Приготовление и растворы.. 57

2.1.2 Рабочая установка для поддержания срезов и манипуляторы.. 58

2.1.3 Идентификация клеток с помощью световой микроскопии. 60

2.2 Регистрация и анализ полевых потенциалов. 63

2.3 Записи и анализ токов (потенциалов) в режиме фиксации потенциала (тока) с одиночных нейронов. 65

2.3.1 Электроды и внутриклеточные растворы.. 65

2.3.2 Проведение регистраций и сохранение данных. 69

2.3.2 Анализ спонтанных и вызванных ответов в режиме фиксации потенциала. 70

2.4 Записи и анализ ответов на ионтофоретические аппликации. 73

2.5 Записи и анализ токов с outside-out patch. 75

2.5.1 Приготовление outside-out patch. 75

2.5.2 Система быстрой аппликации веществ. 75

2.5.3 Определение биофизических свойств рецепторов с использованием анализа токов, полученных с outside-out пейчей. 78

2.6 Модели эпилептогенеза in vivo. 80

2.6.1 Электрический киндлинг. 80

2.6.2 Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный киндлинг. 82

2.7 Использованные вещества. 83

2.8 Статистический анализ. 85

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИй И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.. 86

3.1 Нетипичные фармакологические свойства ГАМКергических рецепторов в гиппокампальных интернейронах. 86

3.1.1 Различная чувствительность ионотропных ГАМКергических рецепторов к пикротоксину в интернейронах и пирамидных клетках. 86

3.1.2 Ионные каналы ионотропных ГАМКергических рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках имеют различную проводимость. 88

3.1.3 Ионотропные ГАМКергические рецепторы как в интернейронах, так и пирамидных клетках чувствительны к агонисту ГАМК_С рецепторов. 90

3.1.4 Пентобарбитал по-разному модулирует ГАМКергические токи, вызываемые аппликацией CACA (50 mМ) 95

3.1.5 ТПСТ в интернейронах, регистрируемые в присутствии 100 mМ пикротоксина, обладают повышенной чувствительностью к антагонисту ГАМК_С рецепторов. 97

3.1.6 Токи, опосредованные ГАМКергическими рецепторами, в присутствии 100 mМ пикротоксина возникают за счет характерной Cl^-/HCO3^- ионой проводимости. 98

3.1.7 Эффект аллостерических модуляторов ГАМК_А рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные ГАМКергическими рецепторами. 102

3.1.8 Сравнение эффективности антагонистов ГАМК_А и ГАМК_С рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные ГАМКергическими рецепторами. 106

3.1.9 Интернейроны содержат рецепторы, обладающие нетипичными фармакологическими свойствами. 109

3.1.10 Нетипичные ГАМКергические рецепторы и традиционные типы рецепторов (ГАМК_А и ГАМК_С) 113

3.1.11 Возможная субъединичная композиция нетипичных ГАМКергических рецепторов в интернейронах. 115

3.1.12 Заключение. 117

3.2 Регуляция возбудимости нейронов гиппокампа за счет ГАМКергического тонического торможения. 119

3.2.1 Базовый тонический ГАМКергический ток специфичен для интернейронов, но не пирамидных клеток. 119

3.2.2 Увеличение внеклеточной концентрации ГАМК ведет к возникновению тонического тока в пирамидных клетках и повышению в интернейронах. 123

3.2.3 Температурная зависимость тонического ГАМКергического тока и фазических спонтанных ТПСТ. 126

3.2.4 Возможная роль тонического торможения в эпилептогенезе. 129

3.2.5 Заключение. 133

3.3 Модуляция ГАМКергической передачи в гиппокампе метаботропными рецепторами 135

3.3.1 L-AP4 подавляет и тормозные, и возбуждающие синаптические токи в интернейронах 135

демонстрирующих отсутствие метаботропных рецепторов группы III на терминалях коллатералей Шаффера, оканчивающихся на пирамидных клетках СА1. 139

3.3.2 Синаптически высвобождаемый глутамат снижает ТПСТ. 139

3.3.3 Глутамат опосредует гетеросинаптическую депрессию ТПСТ. 141

3.3.4 Изменения в эффективности обратного захвата глутамата влияет на гетеросинаптическую депрессию.. 143

3.3.5 Метаботропные рецепторы группы III опосредуют гетеросинаптическую депрессию по двум различным механизмам.. 147

3.3.6 Метаботропные рецепторы группы III модулируют частоту спонтанных ТПСТ. 149

3.3.7 Возможные молекулярные механизмы депрессии ТПСТ при активации mGluR группы III 152

3.3.8 Последствия активации mGluR группы III для общей возбудимости нейрональной сети поля СА1. 153

3.3.9 Гетеросинаптическая депрессия, опосредованная метаботропными ГАМК_B рецепторами 159

3.3.10 Заключение. 161

3.4 Каинатные рецепторы модулируют ГАМКергическое торможение в гиппокампальных интернейронах. 162

3.4.1 Каинат увеличивает частоту и амплитуду спонтанных ТПСТ в интернейронах. 162

3.4.2 Каинат увеличивает вероятность генерации антидромных потенциалов действия в интернейронах. 164

3.4.3 Каинат вызывает спонтанные аксональные потенциалы действия. 168

3.4.4 Спилловер глутамата активирует аксональные каинатные рецепторы.. 171

3.4.5 Последствия аксональной деполяризации, вызываемой каинатными рецепторами, для ГАМКергической передачи. 173

3.4.6 Каинат усиливает вызванные ТПСТ в интернейронах. 177

3.4.7 Каинат приводит к увеличению ГАМКергического тонического тока. 182

3.4.8 Последствия усиления ГАМКергической передачи в интернейронах, вызываемой каинатными рецепторами, для возбудимости нейрональной сети. 185

3.4.9 Заключение. 188

3.5 Оказывают ли метаботропные рецепторы группы III и каинатные рецепторы противоположное действие на ГАМКергическую передачу?. 189

3.6 Механизмы развития пачечной активности в гиппокампе. 192

3.6.1 Кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия создают долговременное снижение порога развития пачечных разрядов в поле СА1 гиппокампа. 192

3.6.2 Развитие пачечных разрядов в поле СА1 гиппокампа не зависит от активности нейронов поля СА3. 194

3.6.3 Окклюзия развития пачечных разрядов в поле СА1 в ответ на кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия в моделях эпилептогенеза in vivo. 195

3.6.4 Является ли пачечная активность в поле СА1 гиппокампа эпилептиформной?. 200

3.6.5 Способность пирамидных нейронов поля СА1 генерировать пачечные разряды сопровождается повышением возбудимости этих клеток. 202

3.6.6 Роль NMDA рецепторов и L-типа кальциевых каналов в повышение возбудимости пирамидных клеток и генерации пачечных разрядов. 206

3.6.7 Заключение. 209

Заключение.. 211

Клеткоспецифичность ГАМКергического торможения в гиппокампе. 213

Клеткоспецифичность модуляции ГАМКергического торможения в гиппокампе. 214

Возбудимость и торможение в эпилептогенезе. 216

 

Выводы... 221

список рисунков.. 224

Список литературы... 227

Сокращения и глоссарий

ТД – ток действия. Ток, регистрируемый при генерации потенциала действия в режиме фиксации потенциала.

ПД – потенциал действия

ТПСТ – тормозный постсинаптический ток, регистрируется при активации тормозных постсинаптических рецепторов (в данной работе ГАМК ергических рецепторов) в режиме фиксации потенциала.

ГАМК – гамма-аминомаслянная кислота (ГАМК ергические рецепторы- рецепторы, эндогенным агонистом которых является ГАМК. Это основные тормозные рецепторы в ЦНС.

NMDA – N-метил-D-аспартат (NMDA рецепторы – глутаматергические рецепторы, связанные, как правило, с Ca²⁺ приводимостью, при физиологических условиях в большинстве случаев канал этих рецепторов блокирован Mg²⁺)

ток компенсации – ток, который подает усилитель на клеточную мембрану в режиме whole cell с целью фиксации необходимого потенциала. Изменения в токе компенсации отражают медленные изменения в потенциале мембраны, например, изменения тонической проводимости. Блокада ионотропных рецепторов и каналов, как привило, приводит к снижению тока компенсации. Устойчивый рост тока компенсации в течение эксперимента может отражать ухудшение состояния клетки и ее гибель (падение потенциала покоя требует большего тока для фиксации потенциала).

whole cell (англ. целая клетка) – в данном контексте означает проведение записей с целой клетки с использованием метода пейч-кламп.

ЦНС - центральная нервная система

входное сопротивление – сопротивление, основным компонентом которого является сопротивление клеточной мембраны. В данной работе входное сопротивление измерялось в ходе каждого эксперимента в режиме фиксации потенциала по форме тока вызываемого кратковременным гиперполяризующим сдвигом потенциала.

mGluR (от англ. metabotropic glutamate receptors) – метаботропные рецепторы глутамата. Делятся на три группы I, II и III. Каждая группа включает в себя также несколько классов рецепторов.

AMPA – α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолепропионат, агонист AMPA /каинатных рецепторов глутамата. AMPA рецепторы – ионотропный подтип глутаматергических рецепторов, опосредующий основную часть возбуждающей глутаматергической синаптической передачи.

uptake (от англ. поглощение) – термин, определяющий обратный захват нейропередатчика, высвободившегося при синаптическом событии. Как правило, он осуществляется благодаря глиальным и нейрональным транспортерам и предотвращает чрезмерное повышение внеклеточной концентрации нейропередатчиков.

РТХ – пикротоксин, антагонист ионотропных ГАМКергических рецепторов.

ВПСТ - возбуждающий постсинаптический ток, регистрируется при активации возбуждающих постсинаптических рецепторов (в данной работе глутаматергических рецепторов) в режиме фиксации потенциала.

с.о.с – стандартная ошибка среднего, статистический параметр (см. Материалы и методы)

спилловер (от англ. spillover – растекание, в данном случае, нейропередатчика) – термин, определяющий тип диффузной нейропередачи, когда нейропередатчик способен покидать синаптическую щель и активировать внесинаптические рецепторы или рецепторы в соседних синапсах.

ВПСП – возбуждающий постсинаптический потенциал (см. также ВПСТ; пВПСТ – полевой ВПСТ, потенциал, регистрируемый внеклеточным электродом с целой популяции синапсов)

популяционный спайк(ПС) – суммарный ответ, получаемый при регистрации внеклеточным электродом в случае, когда несколько клеток одновременно генерируют потенциал действия. Амплитуда популяционного спайка отражает число, амплитуду и синхронизацию одиночных ПД и служит мерой возбудимости и синхронизации нейронов.

потенциал волокон (пВ) – потенциал, регистрируемый внеклеточным электродом при активации группы пресинаптических волокон и возникающий в ответ на электрическую стимуляцию. Представляет собой суммацию потенциалов действия волокон, а его амплитуда, следовательно, отражает число одиночных потенциалов действия на данную силу стимула и возбудимость стимулируемых аксонов.

LTP (от англ. long term potentiation) – долговременная потенциация синаптической передачи. Термином, как правило, определяется состояние повышения эффективности глутаматергической синаптической передачи в результате предшествующей высокой активности данного синапса.

ПДС – пароксизмальный деполяризационный сдвиг. Резкий деполяризующий сдвиг мембранного потенциала нейрона, который приводит к генерации пачечного разряда. Считается одним из механизмов формирования эпилептиформной активности.

окклюзия – термин, который в данной работе использован для обозначения факта, что развитие одного электрофизиологического состояния препятствует развитию другого. В частности, развитие пачечной активности при эпилептогенезе в моделях in vivo не позволяло развиваться дополнительным спайкам в модели пачечной активности in vitro. Наличие окклюзии указывает на возможное сходство механизмов развития двух процессов.

Введение

Актуальность проблемы

Соотношение тормозной и возбуждающей систем нейропередачи в центральной нервной системе закладывает основу для обработки и сохранения информации мозгом. Нарушение этого баланса приводит к развитию ряда нейродегенеративных заболеваний, в частности эпилепсии. Не смотря на длительную историю изучения тормозных и возбуждающих нейронов, синаптической передачи между этими клетками и механизмов ее модуляции, достигнуто сравнительно немного в направлении излечения патологических состояний мозга.

Использование современных методов, технологий и достижений фармакологии позволило, тем не менее, сделать определенный успех в данной проблематике. В частности, описаны основные типы рецепторов глутамата и ГАМК, главных возбуждающего и тормозного медиаторов головного мозга (Barnard et al. 1998; Chen et al. 2001). Идентифицированы основные возбуждающие и тормозные пути синаптической передачи. При этом, казалось бы, логичная синаптическая модель построения мозга оказалась недостаточной, для того чтобы реалистично описать функционирование системы в целом.

Таким образом, задачей современной науки стала детализация и уточнение функциональных изменений в синаптической передаче и возбудимости нервных клеток. Для этого проводятся исследования субъединичного состава рецепторов и поиск специфических активных веществ (блокаторов, активаторов, аллостерических модуляторов этих рецепторов); биохимических каскадов, запускаемых активацией рецепторов; особенностей высвобождения, поглощения и синаптического/внесинаптического действия нейропередатчиков; интеграции и взаимодействия различных систем нейропередатчиков. Так было показано, что ГАМКергические рецепторы, являясь пентомерами, имеют различную субъединичную (субъединиц насчитывается, по современным данным, 18 классов) комбинацию в зависимости от типа и локализации нейрона. Логично предположить, что подобная гетерогенность рецепторов определяет высокую клеточную и синаптическую специфичность ГАМКергического торможения в мозге при использовании одного и того же эндогенного агониста (ГАМК). На практике это означает, что эффективность торможения будет зависеть не только от числа тормозных терминалей на клетке и не только от их способности эффективно высвобождать медиатор, но и от того, как постсинаптическая клетка на него будет реагировать.

С другой стороны, современные иммуноцитохимические и электрофизиологические исследования показали, что расположение рецепторов различных нейропередатчиков и эффект их активации не ограничивается лишь локальным постсинаптическим участком (Isaacson 2000; Soltesz and Nusser 2001; Vizi and Kiss 1998). Внесинаптические рецепторы могут находиться на соме, дендритах и, даже, аксоне клетки. Роль этих рецепторов привлекает значительное внимание и остается до конца не изученной. Предполагается, что внесинаптические рецепторы являются своего рода “детекторами” внеклеточной концентрации медиаторов и специфически балансируют возбудимость клеток. Например, при эпилептиформной активности или нарушении обратного захвата медиаторов концентрация глутамата и ГАМК возрастает в межклеточном пространстве (Kullmann 1999). В этом случае, клетки содержащие внесинаптические возбуждающие и/или тормозные рецепторы будут менять свою возбудимость в соответствии с этим увеличением. Такие изменения, в зависимости от их интенсивности и типа клетки, на которую они воздействуют (это может быть тормозный интернейрон или возбуждающий нейрон), будут иметь эпилептогенный или, наоборот, антиэпилептогенный эффект.

Одной из структур мозга, обладающей повышенной чувствительностью к эпилептогенезу, является гиппокамп, клеточная организация которого довольно хорошо изучена (Freund and Buzsaki 1996; Vizi and Kiss 1998). Тем не менее, остается до конца не ясным, какие механизмы вовлекаются на уровне разных типов клеток в эпилептиформную активность. До последнего времени бытовал упрошенный взгляд на соотношение тормозной и возбуждающей передачи в этой структуре. Основные возбуждающие связи были представлены глутаматергическими гранулярными клетками зубчатой фасции и пирамидными клетками полей СА1-СА3 и субикулюма. Тормозная система представлялась ГАМКергическими интернейронами, диффузно расположенными в ткани и имеющими моносинаптические контакты с возбуждающими клетками. Такая схема не могла объяснить полностью все эффекты на клеточном уровне, которые возникали при эпилепсии. Представление о сложности синаптических связей в сети интернейронов, когда торможению подвергаются не только возбуждающие клетки, но и сами интернейроны, позволило расширить наши представления об обработке сигнала и патогенезе в гиппокампе. Принимая во внимание, всевозможные внесинаптические события и клеточную специфичность рецепторов нейропередатчиков, открылось целое направление исследований, которое может привести к более глубокому пониманию процессов обработки информации в мозге и разработке специфически действующих лекарственных препаратов, высокоэффективных при том или ином нейродегенеративном заболевании. Этому направлению исследований и посвящена представленная диссертационная работа.

Научная новизна

1. В представленной работе, впервые, показано наличие в гиппокампе ГАМКергических рецепторов с характерной для ГАМК_С фармакологией. Прежде считалось, что эти рецепторы находятся в основном в ретине.

2. В интернейронах гиппокампа описан ГАМКергический ток, опосредованный рецепторами, которые не могут быть отнесены ни одному из известных типов ГАМКергических рецепторов. Их фармакологический профиль совмещает в себе свойства как ГАМК_А, так и ГАМК_С рецепторов. Эти рецепторы клеткоспецифичены и не обнаружены в пирамидных нейронах.

3. Впервые показано, что в гиппокампальных интернейронах, но не пирамидных клетках, при обычных условиях помимо фазического торможения (ГАМКергических ТПСТ) существует пикротоксин-чувствительный тонический ток, опосредованный ионотропными ГАМКергическими рецепторами.

4. Увеличение внеклеточной концентрации ГАМК приводит к возникновению тонического тока как в интернейронах, так и в пирамидных клетках. Этот ток отличается по фармакологическим свойствам от базового тонического тока в интернейронах.

5. Впервые представлено электрофизиологическое доказательство наличия глутаматергических метаботропных рецепторов в тормозных ГАМКергических синапсах интернейронов, но не пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа. Эти рецепторы (относящиеся к группе III) активируются спилловером глутамата с соседних глутаматергических синапсов и снижают вероятность выброса ГАМК.

6. Представлено доказательство того, что метаботропные ГАМК_B рецепторы, находящиеся на тормозных терминалях интернейронов могут активироваться за счет спилловера ГАМК с соседних терминалей.

7. Впервые показано наличие каинатных рецепторов в аксонах интернейронов гиппокампа. Активация этих рецепторов за счет спилловера глутамата с возбуждающих терминалей снижает порог генерации потенциалов действия в аксонах интернейронов.

8. Блокада NMDA рецепторов, модулирующих глутаматергическую передачу, снижает, но не достаточна, чтобы подавить пачечную активность в срезах гиппокампа.

9. Блокада L-типа потенциал-зависимых кальциевых каналов (изменяющих возбудимость клеток и модулирующих ГАМКергическую передачу) полностью подавляет пачечную активность.

Обзор литературы

Торможение в гиппокампе

По причине того, что гиппокамп играет центральную роль в формировании памяти, а также в ряде форм эпилептогенеза, большое внимание уделяется механизмам регулирующим возбудимость этой структуры. Существует несколько особенностей возбуждающей глутаматергической нейропередачи, которые могут объяснить повышенную чувствительность гиппокампа к инициации и/или распространению судорожной активности. Например, это наличие как минимум двух форм долговременной потенциации и существование взаимных возбуждающих связей между пирамидными нейронами в поле СА3. Помимо глутаматергической системы, важную роль в возбудимости гиппокампа играет тормозная ГАМКергическая система, представленная интернейронам. Не смотря на то, что эти клетки, традиционно рассматриваются, как тормоз в распространении возбуждения, они могут также иметь дезингибирующее действие, если иннервируют другие интернейроны. Кроме того, сеть взаимосвязанных интернейронов играет ключевую роль в синхронизации активности пирамидных клеток (Cobb et al. 1995; Whittington et al. 1995). Этот феномен может быть как механизмом генерации нормальных ритмов, так и принимать участие в патологических популяционных разрядах в гиппокампе.

ГАМКергические рецепторы

ГАМК действует на две основные группы рецепторов - ионотропные ГАМК_А/ГАМК_С (Рис.1.1) и метаботропные ГАМК_В рецепторы (Bormann 2000a). В настоящее время правомерность деления ионотропных рецепторов на два типа А и С активно дискутируется. В данном обзоре литературы для сохранения объективности рассмотрение типов ГАМКергических рецепторов проводится в алфавитном порядке “ABC”.

 

 

 

 

Рис. 1.1 Фармакологические характеристики ионотропных ГАМКергических рецепторов

а, Схема ГАМК_А рецептора, на которой показаны агонисты: ГАМК, изогувазин; конкурентный антагонист бикукуллин, действующий на сайт связывания агонистов. Показаны сайты аллостерических модуляторов: бензодиазепинов и барбитуратов. Неконкурентный антагонист пикротоксин действует на участок внутри канала ГАМК_А рецепторов. б, схема ГАМК_С рецептора, на которой показаны агонисты: ГАМК, CACA; конкурентный антагонист TPMPA, действующий на сайт связывания агонистов. Сайты аллостерических модуляторов отсутствуют. Пикротоксин также является неконкурентным антагонистом ГАМК_С рецепторов, хотя и менее эффективным, чем ГАМК_А.

 

 

ГАМК_А

ГАМК_А рецепторы у млекопитающих состоят из, как минимум, 16 субъединиц, которые сгруппированы в семь классов: α, β, γ, δ, ε, π и σ (Costa 1998; Mehta and Ticku 1999). Комбинации этих субъединиц дают множество изоформ рецепторов. Причем композиция субъединиц определяет специфичность эффектов аллостерических модуляторов ГАМК_А рецепторов, таких как нейростероиды, цинк, бензодиазепины и барбитураты (Mehta and Ticku 1999). Композиция субъединиц также определяет кинетику активации рецепторов и может оказывать влияние на их десенситизацию (Bianchi et al. 2001). Интересно, что наличие тех или иных субъединиц в ГАМКергическом рецепторе зависит и от его локализации. Так, например, α₂ субъединица находится исключительно в сомато-дендритных синапсах, но не в тормозных синапсах на начальном сегменте аксона (Nusser et al. 1996). Наконец, композиция субъединиц ГАМК_А рецепторов может меняться в нейронах во время эпилептогенеза и эти изменения отражаются в фармакодинамике лекарственных препаратов (Brooks-Kayal et al. 1998).

Из 16 субъединиц ГАМК_А рецепторов только 10 экспрессируются в достаточном количестве гиппокампе (Sperk et al. 1997). Этого вполне хватает, чтобы создать значительную гетерогенность ГАМКергических рецепторов в различных участках данной структуры. Считается, что типичные гиппокампальные рецепторы содержат одну-две α субъединицы и одну-две β. Поскольку рецептор состоит из 5 субъединиц, то в дополнение к ним присоединяются одна-две либо γ, либо δ субъединицы (предполагается, что вместе γ и δ субъединицы не входят в состав одного рецептора). Наличие γ субъединицы влияет на разные параметры ГАМКергического рецептора. В частности, γ субъединица взаимодействует с гефирином, цитоскелетным белком, играющим важную роль в "заякоривании" ГАМКергических рецепторов в синаптической щели (Essrich et al. 1998). ГАМКергические рецепторы, содержащие δ субъединицу, преимущественно располагаются вне синапса. Значение синаптических и внесинаптических рецепторов ГАМК будет обсуждено далее (см. раздел 1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического торможения).

В синаптическом ответе ГАМК_А рецепторы определяют быстрый компонент тока. Канал ГАМК_А рецептора проницаем для ионов хлора и, в некоторой степени, для бикарбоната. Поэтому эффект активации данных рецепторов будет зависеть от электрохимического градиента для вышеуказанных ионов на постсинаптической мембране (Macdonald and Olsen 1994). В нервной системе взрослых животных внеклеточная концентрация ионов хлора выше внутриклеточной, что приводит к более негативному потенциалу реверсии для хлорного тока, чем потенциал покоя клеток. Таким образом, активация ГАМК_А рецепторов приводит к входу ионов Сl^- в нейрон и к гиперполяризации клетки. Необходимый градиент ионов хлора поддерживается калий/хлор котранспортером KCC2 (Rivera et al. 1999), который начинает выкачивать Сl^- наружу после синаптического события. Отсутствие данного транспортера в незрелых гиппокампальных нейронах определяет относительно высокую внутриклеточную концентрацию ионов хлора, что ведет к более позитивному потенциалу реверсии для этого аниона, чем потенциал покоя клеток. В этом случае, активация ГАМК_А рецепторов приводит к деполяризации нейронов (Ben-Ari et al. 1994; Ganguly et al. 2001; Rivera et al. 1999). Однако, и во взрослом мозге, в котором ГАМК_А рецепторы являются гиперполяризующими, продолжительная активация ГАМКергических терминалей может привести к длительному деполяризующему потенциалу (Jackson et al. 1999a). Этот потенциал частично опосредуется внеклеточным накоплением калия, высвобожденного при активации KCC2 (Smirnov et al. 1999).

Аллостерические модуляторы ГАМК_А рецепторов

В ГАМК_А рецепторе (Рис.1.1) существует целый ряд модуляторных сайтов, отличных от сайта связывания агониста. Вещества, воздействующие на данные сайты, повышают или, наоборот, снижают эффективность активации ГАМК_А рецепторов агонистом (Johnston 1996). Одним из таких сайтов аллостерических модуляторов является бензодиазепиновый сайт. Этот сайт представляет собой мишень для ряда препаратов, используемых в клинической практике: антиконвульсантов, седативных и гипнотических средств. Активация бензодиазепинового сайта ведет к увеличению аффинности к агонисту у определенной группы, но не всех, ГАМК_А рецепторов. Было показано, что токи, опосредованные низкоаффинными ГАМКергическими рецепторами, в гиппокампе усиливаются бензодиазепинами в гораздо большей степени, чем опосредованные высокоаффинными рецепторами (Schonrock and Bormann 1993). Различия ГАМКергических рецепторов по их чувствительности к бензодиазепинам, могут быть объяснены также различным составом входящих в них субъединиц. Это подтверждается тем, что диазепам приводит к увеличению величины ГАМКергического тока лишь при наличии γ₂ субъединицы в ГАМК_А рецепторах (Pritchett et al. 1989). Другим сайтом, аллостерической модуляции ГАМК_А рецепторов является сайт барбитуратов (Рис. 1.1). ГАМК_А рецепторы, чувствительные к барбитуратам более широко распространены в мозге, чем чувствительные к бензодиазепинам (Johnston 1996). В отличие от бензодиазепинов, увеличивающих аффинность ГАМКергического рецептора к агонисту, барбитураты увеличивают время открытого состояния и проводимость каналов ГАМКергического рецептора (Eghbali et al. 2000). Барбитураты также, как и бензодиазепины, используются в качестве антиэпилептических и седативных веществ. Сверхдозы пентобарбитала применяются для эфтаназии.

Кроме бензодиазепинов и барбитуратов специфичным модулирующим действием на ГАМК_А рецепторы обладают нейростероиды и цинк (Mehta and Ticku 1999).

ГАМК_В

Метаботропные ГАМК_В рецепторы представляют собой гетеродимеры (Mohler and Fritschy 1999), состоящие из двух субъединиц: GBR₁ и GBR₂ (Jones et al. 1998). Эти две субъединицы возникают благодаря альтернативному сплайсингу (Kuner et al. 1999). Определено, что ГАМК_В рецепторы находятся как пре-, так и постсинаптически (Couve et al. 2000; Mott and Lewis 1994). Тем не менее, достаточно мало известно об их субклеточном распространении (Fritschy et al. 1999). Другими словами, не вполне понятно, группируются ли, например, постсинаптические ГАМК_В рецепторы в синаптической щели напротив места выброса ГАМК или расположены на удалении от синапса. Постсинаптическим эффектом активации данных рецепторов является длительная гиперполяризация, следующая за быстрым ионотропным компонентом ГАМКергической передачи. В своем недавнем исследовании Scanziani (Scanziani 2000) приводит аргументы в пользу того, что ГАМК_В рецепторы расположены далеко от места выброса медиатора и активируются ГАМК, покидающей синаптическую щель (спилловер ГАМК). При этом он считает, что для достижения достаточной для активации данных рецепторов внеклеточной концентрации ГАМК необходима одновременная активация нескольких ГАМКергических синапсов.

Не до конца понятно субклеточное распределение и пресинаптических ГАМК_В рецепторов. Не ясно расположены ли эти рецепторы в перисинаптической области или они далеко от активной зоны. Пресинаптический эффект ГАМК_В рецепторов заключается в том, что они снижают как высвобождение ГАМК в тормозных синапсах, так и высвобождение глутамата в возбуждающих (Mott and Lewis 1994).

ГАМК_В рецепторы связаны с тримерным G-белком (Hill et al. 1984). Одним из эффектов их активации является ингибирование аденилатциклазы (Nishikawa et al. 1997). Кроме того, данные рецепторы прямо связаны через G-белок с N и P/Q типами потенциал зависимых кальциевых каналов, которые участвуют в синаптическом высвобождении нейропередатчиков (Anwyl 1991; Mintz and Bean 1993). Таким образом, пресинаптические ГАМК_В рецепторы снижают высвобождение нейропередатчиков уменьшая пресинаптический вход кальция. Наконец, на постсинаптическом участке ГАМК_В рецепторы запускают каскад реакций, который ведет к открыванию G-белок связанных К⁺ каналов (GIRK – G protein-gated inward rectifying K⁺ channels) (Andrade et al. 1986; Misgeld et al. 1995). Благодаря активации этих каналов и возникает медленный ТПСТ, длящийся сотни миллисекунд (Scanziani 2000). По этой причине его легко отличить от ТПСТ, опосредованного ГАМК_А рецепторами. Медленный ТПСТ, опосредованный ГАМК_В рецепторами, будет характеризоваться длительной кинетикой и потенциалом реверсии отличным от E_Cl-.

ГАМК_С

ГАМК_С рецепторы могли бы считаться филогенетически самым старым типом ионотропных ГАМКергических рецепторов (Bormann and Feigenspan 1995). Этот тип объединяет гомомерные рецепторы, состоящие только из ρ-субъединиц, которые в свою очередь делятся на 3 класса: ρ₁, ρ₂ и ρ₃ (Zhang et al. 2001). Данные субъединицы в наибольшем колличестве сосредоточены в ретине позвоночных, хотя обнаружены и в других структурах ЦНС, в частности, гиппокампе (Enz et al. 1995; Enz and Cutting 1999; Ogurusu et al. 1999; Wegelius et al. 1998). Считается, что ρ-субъединицы не образуют гетеромерных рецепторов с другими субъединицами (Hackam et al. 1998; Koulen et al. 1998). Тем не менее, недавно и была продемонстрирована возможность создания гетеромера из ρ и γ₂ субъединиц в ооцитах Xenopus (Qian and Ripps 1999).

Поскольку композиция субъединиц играет ключевую роль в фармакологических свойствах ГАМКергических рецепторов, ГАМК_С рецепторы имеют отличный от ГАМК_А рецепторов фармакологический профиль. Они не чувствительны к бикукуллину, аллостерическим модуляторам и специфическим агонистам ГАМК_А рецепторов. С другой стороны, существуют специфические агонисты и антагонисты этих рецепторов, неактивные для ГАМК_А (основные различия типов рецепторов представлены на Рис.1.1) (Bormann 2000a). Тем не менее, комитет IUPHAR не рекомендовал вводить ГАМК_С рецепторы в классификацию как отдельный тип (Barnard et al. 1998). Он предложил считать эти рецепторы специфическим классом ρ-содержащих ГАМК_А рецепторов. Основные аргументы обходили тот факт, что эти рецепторы имеют отличную фармакологию, структуру, функцию и клеточную локализацию. Вместо этого они делали акцент на том, что выделение ГАМК_С рецепторов как отдельного типа создает возможность для дальнейшего расширения классификации и разрушения удобной системы ГАМК_А/ГАМК_В (ионотропные/метаботропные рецепторы). Поступило, например, предложение ввести новый ГАМК_D тип рецепторов. В эмбриональной ткани цыплят были обнаружены ГАМКергические рецепторы, которые не были чувствительны к антагонистам ни ГАМК_А, ни ГАМК_В рецепторов, но активировались агонистами и ГАМК_А, и ГАМК_В (Momose-Sato et al. 1997). Поступило также предложение “ГАМК_D” рецептора с отличной ионной селективностью канала (Perkins and Wong 1996).

Надо отметить, что идея объединения ионотропных ГАМКергических рецепторов в один тип нашла как своих сторонников, так и своих противников (Bormann 2000a; Zhang et al. 2001). Таким образом, современная классификация ГАМКергических рецепторов еще не окончательно сформирована и требует дополнительных экспериментальных исследований, направленных на поиск сходств и различий между ГАМК_А и ГАМК_С рецепторами.

В заключение можно заметить, что если принять простое деление ГАМКергических рецепторов на ионотропные и метаботропные – ГАМК_А/ГАМК_В, различные комбинации субъединиц ионотропных ГАМКергических рецепторов позволяют существовать целому ряду фармакологически и функционально различных типов торможения. Исходя из этого, одной из задач данной диссертационной работы было определение фармакологического и биофизического профиля гиппокампальных ГАМКергических рецепторов. Мы решили исследовать особенности ГАМКергических рецепторов, принимающих участие в торможении между двумя интернейронами и интернейроном и пирамидной клеткой, и оценить какую это может играть функциональную роль.

Исследования эпилептогенеза

В настоящее время, исследования событий, происходящих в эпилептическом мозге, проводятся в большом числе лабораторий по всему миру. За последние годы был достигнут определенный прогресс в этом направлении. Показаны изменения в клеточном составе (в частности гибель клеток – (Bernard et al. 2000)), составе рецепторов (Schwarzer et al. 1997), возбудимости мембран (Ketelaars et al. 2001) и синаптической пластичности (Kullmann et al. 2000) при эпилептогенезе. Однако, трудно представить, что все эти события должны произойти одновременно, чтобы мозг стал эпилептическим. В данном случае, необходимо четко разделить причину и следствия заболевания. К сожалению, до настоящего времени причина, инициирующая эпилептогенез, не вполне ясна.