Трансдукция и геном человека

В 1955 году Джошуа Ледерберг предположил, что трансдуцирующие вирусы можно использовать для введения генов в клетки человека. В то время такая идея казалась чистой фантазией, но сейчас она все более и более приобретает черты реальности, особенно в свете развития технологии рекомбинант-ных ДНК, описанной в гл. 12.

Трансдукцию можно использовать для того, чтобы: 1) внедрить доминантные «хорошие» гены и исправить наследственный дефектный фенотип; 2) внедрить гены в пищевые растения и увеличить их полезность; 3) изменить бактерии так, чтобы они выполняли полезные биологические функции; 4) вызывать заболевание в определенном организме. Главный технический вопрос заключается в том, могут ли вирусы захватывать гены животных и внедрять их в другие клетки. Ответ на этот вопрос положительный. Например, если вирусом простого герпеса заразить штамм мышиных клеток, в которых отсутствует определенный белок (тимидинкиназа), то у 0,1% клеток появляется нормальный аллель. Нормальный аллель могли привнести только вирусы. Клетки с привнесенным аллелем довольно стабильны и производят тимидинкиназу на протяжении 8 месяцев. В других экспериментах используют аденовирусы и другие вирусы животных, с помощью которых переносят гены, например для лечения генетических заболеваний. Были выведены трансдуцирующие полиомовирусы, которые могут захватывать гены мыши и переносить их в ядро клетки человеческого эмбриона.

Некоторые медицинские технологии иногда разрабатываются до того, как удается определить этические правила их применения. В истории науки так бывало часто, например, когда Бантинг и Бест разрабатывали и тестировали опытные образцы инсулина или когда Кристиан Барнард поразил общественность заявлением об удачной трансплантации сердца. То же можно сказать и о трансдукции генов в клетки человека. В 1958 году Стэнли Роджерс изучал вирус папилломы Шопа, которая вызывает повреждения кожи у кроликов. Он обнаружил у инфицированных клеток высокий уровень содержания фермента аргиназы, вызванный, по всей видимости, генами вируса. В сыворотке крови аргиназа расщепляет аминокислоту аргинин. Затем обнаружилось, что у трети сотрудников лаборатории, работавших с вирусом папилломы Шопа, уровень аргинина меньше обычного. Вероятно, вирус перенес ген аргиназы в клетки людей.

В 1970 году Роджерс узнал о семье из Германии, в которой две сестры (позже родилась третья) страдали от наследственной гипераргинемии, вызванной недостатком аргиназы. В их крови и костном мозге наблюдалось очень высокое содержание аргинина, которое часто приводит к замедлению умственного развития, параличу конечностей и эпилептическим припадкам. Роджерс внутривенно ввел девочкам (в возрасте 2 и 7 лет) вирус папилломы Шопа, а позже ввел его и их пятимесячной сестре. Однако остановить или замедлить развитие заболевания не удалось, и эксперимент сочли неудачным. Тем не менее, он заставляет задуматься, насколько свободно ученые должны экспериментировать с методами, имеющими огромные социальные последствия. Генную терапию попытались применить без всякого представления о вызываемом ею непосредственном эффекте, не говоря уже о долговременных последствиях. Это даже скорее не генная терапия, а технический эксперимент. Фридман и Роблин³ предупреждают, что такое поспешное и необдуманное экспериментирование может «послужить толчком для других попыток в ближайшем будущем», и ратуют за то, чтобы воздержаться от подобных попыток, пока не будет получена дополнительная информация. Роджерс на это возражает:

Когда на руках у врача пациент с безнадежно прогрессирующим заболеванием и когда известно, что ни диетические, ни какие другие меры не помогут, и когда имеется средство, предположительно способное остановить развитие заболевания, причем при помощи агента, подробно исследуемого на протяжении 40 лет, то почти не остается другого выхода, как попробовать им воспользоваться⁴.

Однако биологи редко вспоминают о том, что любой метод, способный исправить дефекты человеческой природы, почти с тем же успехом может быть использован и для того, чтобы намеренно вызвать такие дефекты у нормальных людей.

В 1971 году Карл Меррилл и его сотрудники заявили, что возможно лечить заболевания искусственно разводимых человеческих клеток при помощи трансдуцирующего фага лямбда. Они брали клетки кожи у пациентов, страдающих галактосемией, аутосомным рецессивным заболеванием, характеризующимся неспособностью превращать галактозу в глюкозу (сахар, из которого наш организм черпает энергию). Клетки этих людей не выполняют функцию, присущую одному из генов gal бактерии Е. coli. Заразив дефектные человеческие клетки штаммом, лямбда с бактериальными генами gal⁺, Меррилл и его коллеги получили клетки, в которых уровень необходимого фермента был даже выше обычного. Сами по себе эти эксперименты еще не являются окончательным доказательством трансдукции генов, как и эксперименты Роджерса. Тем не менее, опыты Меррилла позволяют предположить, что фаг лямбда может встраивать бактериальные гены в клетки человека и вызывать заметный эффект. Как мы увидим в дальнейшем, сейчас разработаны еще более изощренные способы переноса генов из одного организма в другой. Таким образом, в этой главе мы увидели, как такая, казалось бы, узко специфическая отрасль биологии, как бактериальная генетика, может повлиять на развитие научной мысли и иметь далеко идущие последствия для общества. Например, бактериальные плазмиды и вирусы можно использовать в качестве векторов, которые переносят фрагменты ДНК. Эксперименты с плазмидами и вирусами показали, что они могут реплицировать гены, перемещать их из одной клетки в другую и вставлять дополнительные фрагменты в геном клетки-хозяина. Эти ключевые явления послужили отправной точкой дош развития техники клонирования ДНК и генетической инженерии, о которых говорится в гл. 12.

 

Отбор мутантов Отбор мутантных бактерий, таких как /s (чувствительные к температуре), или ауксотрофные штаммы, обычно начинается с выращивания бактерий и подвергания их воздействию мутагена, то есть вещества или фактора (например, ультрафиолетового света), вызывающего мутации. Если мы хотим получить мутант ts, то нам нужно сделать посев клеток в чашку с агаром и держать их при низкой температуре (28°С), пока не образуется достаточное количество колоний. Затем мы берем цилиндр, конец которого покрыт круглым куском бархатной ткани приблизительно того же диаметра, что и чашка, и слегка промокаем поверхность культуры. Если посмотреть на бархат под микроскопом, можно понять, почему раствор бактерий так легко впитывается в него: бархат представляет собой своего рода спутанный клу-

бок крохотных иголок. Затем мы промокаем этим куском бархата поверхность чашки с чистым раствором, перенося колонии бактерий на новое место и получая реплику первой чашки, то есть ее точную копию. Затем реплику нагреваем до температуры 42°С и сравниваем чашки:

Бактерии, не выросшие на реплике, очевидно, имеют мутацию ts, и их можно отобрать и вырастить для дальнейших исследований. При помощи метода реплик первую чашку можно копировать много раз и тестировать реплики в разных условиях. Например, в первой чашке может содержаться весь набор аминокислот, необходимых для роста бактерий, а реплику можно сделать в чашке с отсутствием некоторых аминокислот, например триптофана. Бактерии, не выросшие в новой среде, скорее всего, являются ауксотрофами trp кодон) (UAG, UGA или UAA), который служит сигналом для прекращения синтеза полипептидной цепи.

 

Глава одиннадцатая