Отбор проб с небольших делянок

На мелкоделяночных по­севах, которые должны быть как минимум в двух повторностях, срезают от 1/3 до 1/2 куста и не менее как с 10 растений в разных местах делянки каждой повторности. Злаковые срезают целиком.

Другой прием сбора состоит в том, что по диагонали срезают не менее 10 растений через одинаковые интервалы или через один рядок на делянке в каждой повторности. Для сравнения различных образцов необходимо иметь данные по стандартному образцу, который высевают через каждые 5—10 образцов и также берут пробы для анализов [12, 20].

Отбор проб с более крупных площадей

Пробы растений от­бирают со всех повторностей опыта. На каждой повторности по диагонали срезают по 1/4 куста от 10-15 растений и помещают в мешки (лучше из водонепроницаемого материала). В дальней­шем для анализа поступают пробы от каждой повторности или средняя проба со всех повторностей.

Сбор растений на значительных площадях рядового и гнез­дового посевов производят по двум диагоналям участка. По каждой диагонали через равные промежутки срезают по 1/3 - 1/4 — куста от каждых 10-15 растений, что доставит пробы 20-30 растений. Уменьшение объема пробы допустимо после предвари­тельного грубого измельчения образца.

Большое внимание должно быть уделено составлению сред­них проб листостебельной массы таких растений, как кукуруза, сорго, подсолнечник, топинамбур, кормовая капуста и другие однолетние растения, используемые для кормовых целей. В этих случаях срезают на высоте 10-12 см от земли 10 растений. Отобранные образцы, перевязанные и снабженные этикеткой с необходимыми сведениями, должны сразу же поступать в лабораторию для подготовки к анализу.

Для уменьшения веса влитых растений каждое из них разре­зают вдоль на 2 части, одну из которых употребляют для анализа. Дальнейшее деление пробы допускается только после из­мельчения всех проб на отрезки длиной 1,5-2 см [12].

Подготовка проб кормовых растений к анализу

Так как одной из поставленных целей исследования является доказательство утверждения об использовании зеленой массы анализируемого растения в качестве корма или добавки в комплексе с зимними кормами, то целесообразно отразить в обзоре литературы общую характеристику подготовки проб кормовых растений к анализу.

Среднюю пробу растений, взятую в поле в тот же день, об­рабатывают в зависимости от целен изучения и предполагаемых анализов. Для химической оценки высушенных образцов (сена) по общему содержанию химических веществ срезанные растения в виде снопов (лучше в капроновой сетке) подвешивают на укрепленных жердях в крытых помещениях. Когда растения до­стигнут воздушно-сухого состояния, их помещают в марлевые мешки. Применение марлевых мешков необходимо для того, что­бы предупредить потерн листьев высушенных растений. Однако часто необходимо знать содержание сухих веществ в листостебельной массе; в этом случае взвешивают пробы (снопы) перед сушкой и после высушивания до воздушно сухого состояния и, определив содержание влаги в сене, вычисляют в исходном образце содержание сухих веществ в процентах.

Для анализа отдельных органов растения их сразу разделяют на части (работу ведут в тени) и каждую часть высушивают в марлевом мешке; стебли при этом лучше разрезать на части.

Для оценки химического состава растений в свежем виде взятые образцы (пробы) немедленно измельчают и приступают к их обработке, направленной к прекращению деятельности фер­ментов. Под влиянием различных ферментов в срезанных расте­ниях происходит распад белковых веществ, полисахаридов и дру­гих соединений, что не позволяет получить правильного представ­ления о первоначальном химическом составе взятых образцов.

Для этого измельченные на стеблерезке или другим путем пробы помещают рыхлым слоем в кюветы (эмалированные) или алюминиевые пластины и прогревают в стерилизаторном шкафу и здесь же высушивают. Можно обрабатывать также паром, поместив листостебельную массу в алюминиевых ситах (диаметр 18-20 см) на 10-15 мин над кипящей водой в большую кастрюлю. После этого потерявшую тур гор листостебельную массу высушивают в термостате (с вентиляцией или без нее).

Высушенные до воздушно-сухого состояния пробы листостебельной массы перед размельчением до необходимого помола подсушивают в течение 3-4 часов при 45° и еще в теплом состоя­нии размельчают на мельнице или мясорубке до грубого помо­ла затем отделяют часть последнего и размельчают до более тонкого помола на мельнице типа «Пируэт». Измельченный ма­териал хранят в стеклянных банках с пробкой или в пакетах из поливиниловой пленки в эксикаторах [20].

 

1.2. Методы определения содержания углеводов в растениях

Содержание углеводов и их разнообразие определяется видом растения, фазой развития, абиотическими факторами среды и изменяются в широких пределах. Определение углеводов в растительной продукции позволяет: установить закономерности обмена этих веществ; оценить качество зеленой массы, плодов, овощей и возможность их технической переработки; В здравоохранении составить энергетический баланс, в зоотехнии рассчитать пищевой рацион [25].

Существуют количественные методы определения моносахаридов: химические, поляриметрические. Определение полисахаридов в растениях осуществляется теми же методами, но прежде кислородная связь этих соединений разрушается в процессе гидролиза [19, 22].

В некоторых источниках указывается на цианидный метод, который является быстрым, простым с точки зрения используемых реактивов и при соблю­дении рекомендуемой техники анализа дает вполне удовлетвори­тельные результаты. Метод используют для определения сахаров в овощах, плодах и корнеплодах. Он основан на способности железосинеродистого калия (красной кровяной соли) в щелочной среде окислять редуцирующие сахара. Реакцию осуществляют путем титрования раствором исследуемого сахара кипящего щелочного раствора железосинеродистого калия в присутствии метиленовой сини в качестве индикатора. Содержание моносахаров (редуцирующих Сахаров) вычисляю по количеству титрованного раствора железосинеродистого калия и объему израсходованного на его титрование раствора сахара неизвестной концентрации [21, 6].

В практике широко используется определение углеводов по Бертрану. Растворимые углеводы извлекаются из растительного материала горячей дистиллированной водой. В одной части фильтрата определяют моносахариды, в другой – после гидролиза соляной кислотой ди- и трисахариды, которые распадаются при этом до глюкозы. Метод основан на способности моносахаридов, содержащих альдегидную группу, восстанавливать феллингову жидкость [18, 21, 22].

Отдельные авторы в своих работах указывают на определение углеводов фотометрически с пикриновой кислотой (модификация Соловьева). Моносахариды, имеющие альдегидную или кетонную группировку, могут восстанавливать динитросоединения, при этом образуются интенсивно окрашенные соединения. Окраска пропорциональна количеству углеводов в реакции, поэтому возможно их колориметрическое определение. В этом случае используют реакцию восстановления пикриновой кислоты (2,4,6-тринитрофенола) в пикраминовую [20].

К. П. Петров приводит определение редуцирующих сахаров (по Офнеру). С целью упрощения метода Офнер для определения редуцирующих веществ предложил раствор, в состав которого входит медный купорос, сегнетовая соль и карбонат натрия. Таким образом, в этом растворе концентрация ионов гидроксила понижена по сравнению с реактивом фелинга, и поэтому раствор хорошо сохраняется. Редуцирующие сахара окисляются несколько медленнее, чем с раствором фелинга. Однако, используя этот метод, не надо отфильтровывать Сu2О, так как его количество легко определяется иодометрическим титрованием.

Иодометрическим методом определяют оставшийся невосстановленный нон Сu²⁺ или непосредственно Сu2О. При этом используют ту же обратимую реакцию, только равновесие должно быть смещено влево. Весь Сu2О, перед окислением иодом, переводят в раствор, прибавляя достаточное количество НСl. Избыток иода оттитровывают раствором тиосульфата натрия и, таким образом (по разности), определяют количество иода, связанного Сu2О [17].

Для измерения количественного содержания дисахаридов (сахарозы) удобнее всего использовать оптический метод. Он основан на способности сахарозы в водных растворах вращать плоскость поляризации световых лучей [21].

1.3. Методы определения хлорофилла в растениях

Под названием хромопротеиды объединяют все цветные белки. Типичным представителем хромопротеидов является гемоглобин крови. Сходным по структуре с гемом гемоглобина крови и других сложных белков (ферментов) является хлорофилл растений, который связан также с белком.

Хлорофилл принадлежит к группе жирорастворимых пигментов, он растворяется в жирах и органических растворителях. Хлорофилл, как показали работы К. А. Тимирязева и его последователей, играет огромную роль в процессе ассимиляции углекислого газа. Процесс фотосинтеза представляет собой окислительно-восстановительное взаимодействие углекислого газа и воды, идущее в присутствии хлорофилла, который поглощает энергию солнечных лучей. Фотосинтез настоящее время является главным источником образования органических веществ на Земле.

К. П. Петров в своей работе «Методы биохимического анализа сырья» приводит метод определения хлорофилла по Т. Н. Годневу. Данный способ анализа заключается в выделении хлорофилла из зеленой части растения 96%-ным раствором этилового спирта и измерении оптической плотности вытяжки [17].

Также количественно хлорофилл можно определить с помощью методов хроматографии (по Сапожникову). Разделение смеси пигментов основывается на селектив­ной абсорбции фильтровальной бумаги. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется раствор, молеку­лы его разделяются на две фазы в соответствии с их коэф­фициентом разделения (подвижная и неподвижная фазы).

Чем больше растворимость пигмента в мобильной фазе, тем дальше он продвинется по хроматографической бумаге вместе с растворителем. В ходе исследования проводят такие операции, как экстракция, извлечение, элюация и количественное определение пигмента [4, 18].

В некоторых источниках подробно описывается спектрофотометрический метод количественного измерения этого хромопротеида. Спектрофотометрический анализ — наиболее точ­ный количественный метод определения содержания пигментов листа. Как и на фотоэлектроколориметре, концентрация пигментов на спектрофотометре опреде­ляется по оптической плотности. Однако в отличие от первого спектрофотометр позволяет выполнять анализ смесей веществ с близкими максимумами поглощения, что достигается за счет использования монохроматора, вследствие чего удается установить содержание хлороиллов и каротиноидов в вытяжке без предварительно­го разделения. Плотность экстракта на спектрофотомет­ре измеряют при длинах волн, соответствующих мак­симумам поглощения хлорофиллов а и b в красной об­ласти спектра и при длине волны абсорбционного мак­симума каротиноидов. При этом учитывают, что поло­жение максимума поглощения несколько меняется в за­висимости от используемого растворителя. Концентра­цию пигментов рассчитывают по уравнениям [4, 23].

Достаточно эффективно и удобно определение концентрации хлорофил­ла на фотоэлектроколориметре (ФЭКе). Для установления концентрации окрашенных растворов на фотоэлектроколориметре измеряют разность силы электрических токов, возникающих между двумя фото­элементами в результате неодинаковой интенсивности световых потоков, прошедших через растворитель и раствор [4, 23].

 

1.4. Методы качественного определения аскорбиновой кислоты в растениях

Качественные реакции на аскорбиновую кислоту (витамин С) основаны на его способности легко вступать в окислительно-восстановительные реакции и восстанавливать, например, метиленовую синь, 2,6-дихлорфенолиндофенол, гексациано-(III) феррат калия, нитрат серебра и др.

В литературе достаточно подробно описывается взаимодействие аскорбиновой кислоты с метиленовой синью, в ходе которого заранее обесцвеченный раствор метиленовой сини вновь приобретает синий цвет [8].

Протекающие при этом реакции можно представить схемами:

Аскорбиновая Анион аскорбиновой Дегидроаскорбиновая

кислота кислоты кислота

Метиленовый синий (окрашенная Метиленовый синий (бесцветная

окисленная форма восстановленная форма

При встряхивании обесцвеченного раствора метиленовой сини на воздухе протекает процесс:

Аскорбиновая кислота, окисляясь, восстанавливает гексациано-(III) феррат калия K3[Fe(CN)6] до гексациано-(II) феррата калия K4[Fe(CN)6], который с ионом железа в степени окисления +3 образует в кислой среде берлинскую лазурь:

берлинская лазурь

(синий осадок)

.

Многие авторы указывают на реакцию с 2,6-дихлорфенолиндофенолом.

К 1 мл сока прибавляют 1 мл 0,02%-ного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенол. Тщательно перемешивают, раствор обесцвечивается за счет образования лейкоформы индикатора. При дальнейшем прибавлении индикатора раствор окрашивается в розовый цвет, так как вся аскорбиновая кислота в пробе уже окислена и 2,6-дихлорфенолиндофенол больше не восстанавливается [10].

Реакция с раствором нитрата серебра.При этом происходит восстановление серебра, а аскорбиновая кислота окисляется в кетоформу. К извлечению прибавляют 1 мл раствора нитрата серебра, при этом выпадает осадок металлического серебра [8].

Реакция с солью железа (II) [8, 10].К 1 мл извлечения добавляют 1 мл раствора гидрокарбоната натрия и 1 мл сульфата железа (II). Наблюдают образование аскорбината железа фиолетового цвета:

.

1.5. Методы качественного определения некоторых биологически активных веществ растений

Определение алкалоидов

Метод Крафта. Метод Крафта может быть рекомендован в качестве полевого экспресс-метода для рекогносцировочной оценки растений на наличие алкалоидов.

а) Каплю свежевыжатого из растения сока наносят на фильтровальную бумагу, пропитанную реактивом Драгендорфа. При наличии алкалоидов в соке на бумаге появляется оранжевое пятно.

б) О наличии алкалоидов можно судить также по оранжевым пятнам, возникающим на местах соприкосновения свежего растения и бумаги при их сжатии. Для проведения анализа методом Крафта необходимо иметь щипцы для сдавливания и индикаторную бумагу, качество которой имеет решающее значение. Небольшой срез того или иного органа растения (лист, стебель, цветы) накладывают на полученную бумагу и с помощью плоскогубцев сдавливают. При наличии алкалоидов, выступивший при сжатии сок окрашивает бумагу в оранжево-красный цвет. При наличии хлорофилла оранжевое окрашивание наблюдается в виде каймы вокруг зеленого пятна

или в виде оранжево-красных участков между зелеными пятнами.

Определение алкалоидов методом извлечения. Растения грубо измельчают, помещают в пробирку, заливают 1% раствором соляной кислоты так, чтобы кислота покрывала весь материал (1:10) и нагревают до начала кипения.

До охлаждения жидкость фильтруют через фильтр и испытывают на присутствие в нем алкалоидов, для чего 1-2 капли фильтрата помещают при помощи стеклянной палочки на часовое стекло, рядом с ним наносят каплю реактива Вагнера и осторожно наклоняя стекло, обе капли соединяют. При слиянии капель, в случае присутствия алкалоидов жидкость мутнеет, а затем происходит выпадение трудно растворимых солей алкалоидов с реактивом Вагнера (осадок бурого цвета) [25, 23].

Определение сапонинов

Реакция пенообразования. Растение грубо измельчают и в пробирке готовят извлечение 1:10 на дистиллированной воде, фильтруют. В одну пробирку помещают 5 мл фильтрата, а в другую. 5 мл дистиллированной воды (контроль). Обе пробирки энергично встряхивают. Содержащие сапонины

настои при этом дают обильную пену, не исчезающую в течение длительного времени.

Реакция с раствором ацетата свинца. К 2 мл настоя прибавляют несколько капель ацетата свинца. Образуется осадок. Причем, терпеновые сапонины осаждаются средним ацетатом свинца, а стероидные - основным.

Реакция Лафона. К 2 мл водного настоя прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл этилового спирта и 10 капель 10% раствора сернокислого железа. При нагревании появляется сине-зеленое окрашивание [25].