Отбор проб вегетативной массы отдельных растений

ВВЕДЕНИЕ

Последнее время для биологической очистки водоемов применяется гидробионт Eichornia crassipes. Очищая стоки от вредных примесей, растение в себе их не накапливает, а "съедает", при этом активно вегетирует. Чем грязнее водоем, тем быстрее оно растет и размножается [13]. Если вода очистилась и питаться нечем, Эйхорния начинает перерабатывать доступный придонный ил. Во избежание этого нами предлагается использование зеленой массы данного растения как в качестве корма или добавки в комплексе с зимними кормами. Тем самым решаются проблемы: выведения из пищевой цепи посевных площадей, обеднения почв, повышения конечной стоимости продуктов питания. Следует отметить, что 1га Эйхорнии экономит 8-10 га посевных площадей [15].

Химический анализ растений – один из основных приемов агрохимического анализа, без которого невозможно решить многие вопросы агрохимии. Анализ растений в агрохимических исследованиях применяют:

1) для изучения влияния почвы и удобрений на биохимические процессы, протекающие в растении в период питания;

2) при определении биологического и хозяйственного выноса элементов питания почвы и удобрений, установления коэффициентов использования питательных элементов;

3) в оценке качества растениеводческой и овощеводческой продукции; для установления питательной ценности растительных кормов;

4) в целях растительной диагностики питания растений и установления доз удобрений, вносимых в качестве основного удобрения и в виде подкормок.

Органические и неорганические вещества, входящие в состав растений, являются основой продуктов питания, лекарств, животных кормов. Поэтому необходим их анализ, который позволяет исследовать трансформацию макро- и микроэлементов в системе почва – растение удобрения при различных режимах выращивания растений; определить содержание основных биокомпонентов в растительных объектах и кормах: белков, жиров, углеводов, витаминов, алкалоидов и соответствие их содержания принятым нормам и стандартам; оценить меру пригодности растений для потребителя; произвести диагностику обеспеченности растений питательными веществами; по признакам обеспеченности производить подкормки [20,2].

Целью данного исследования является изучение биологически активных веществ, входящих в состав Eichornia crassipes с помощью физико-химических методов анализа и выявление влияния стимуляторов роста растений на их количественное содержание.

Перед началом работы нами были поставлены следующие задачи:

1) ознакомится с теоретическими основами физико-химических методов, используемых в биологических исследованиях;

2) освоить общие лабораторные и специальные методы исследования растений;

3) обучиться основам постановки эксперимента, обработки материала исследования;

4) определить наличие и количественное содержание биологически активных веществ первичного синтеза в Е. Crassipes;

5) установить их количественные показатели в зависимости от условий содержания.

 

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Подготовка материала к исследованию. Отбор проб

Отбор растительной пробы ответственный этап работы, требует определенных навыков и опыта. Ошибки при отборе пробы и подготовке к анализу не компенсируется качественной аналитической обработкой собранного материала.

При отборе растений в агро- и биоценозе основная цель – средняя проба растений, которая должна наиболее полно отражать биологическое состояние растений, т.е. быть репрезентативной для поля, опытной делянки, выбранной площадки, вегитационного сосуда. Чтобы средняя проба отражала статус всей совокупности растений, учитывают макро- и микрорельеф, гидротермические условия, равномерность и густоту состояния растений, их биологические особенности.

Растительные пробы отбираются в сухую погоду, в утренние часы, после высыхания росы. При изучении процессов обмена веществ в растениях в динамике эти часы соблюдаются в течение всего вегетативного периода [20].

При взятии проб для биохимической оценки необходимо принимать во внимание не только условия выращивания (чистоту и равномерность травостоя), но и фазу роста, состояние развития и степень облиственности. По харак­теру вегетативной массы все главнейшие кормовые культуры можно разделить на 2 группы: с большой зеленой листостебельной массой (клевер, люцерна) и с малой листостебельной массой (тимофеевка, костер и др.). Главное условие правильного взя­тия полевой пробы — отбор растений в таком соотношении, чтобы взятая проба вполне отображала химический состав материала [12].

В свежем растительном материале при естественной влажности проводят определение водорастворимых форм белков, углеводов, ферментов и др.

Критерием оценки верного отбора пробы является сходимость результатов химического анализа при параллельных определениях [5].

Отбор проб вегетативной массы отдельных растений

Для правильной оценки химического состава отдельных растений по­следние должны быть выращены в одинаковых условиях. Расте­ния срезают в одно и то же время—в 8—10 часов. Сразу после дождя или полива пробы брать не следует. У сильнокустистых растений с большой листостебельной массой (люцерны, клевера, мятлика, овсяницы) срезают около 1/3 куста, а у некоторых зла­ковых (тимофеевки, костра) — не менее 1/2 куста. Свежие рас­тения помещают в пакеты, изготовленные из водонепроницае­мых пленок, и снабжают этикеткой с необходимыми сведениями [12].

Отбор проб с небольших делянок

На мелкоделяночных по­севах, которые должны быть как минимум в двух повторностях, срезают от 1/3 до 1/2 куста и не менее как с 10 растений в разных местах делянки каждой повторности. Злаковые срезают целиком.

Другой прием сбора состоит в том, что по диагонали срезают не менее 10 растений через одинаковые интервалы или через один рядок на делянке в каждой повторности. Для сравнения различных образцов необходимо иметь данные по стандартному образцу, который высевают через каждые 5—10 образцов и также берут пробы для анализов [12, 20].

Отбор проб с более крупных площадей

Пробы растений от­бирают со всех повторностей опыта. На каждой повторности по диагонали срезают по 1/4 куста от 10-15 растений и помещают в мешки (лучше из водонепроницаемого материала). В дальней­шем для анализа поступают пробы от каждой повторности или средняя проба со всех повторностей.

Сбор растений на значительных площадях рядового и гнез­дового посевов производят по двум диагоналям участка. По каждой диагонали через равные промежутки срезают по 1/3 - 1/4 — куста от каждых 10-15 растений, что доставит пробы 20-30 растений. Уменьшение объема пробы допустимо после предвари­тельного грубого измельчения образца.

Большое внимание должно быть уделено составлению сред­них проб листостебельной массы таких растений, как кукуруза, сорго, подсолнечник, топинамбур, кормовая капуста и другие однолетние растения, используемые для кормовых целей. В этих случаях срезают на высоте 10-12 см от земли 10 растений. Отобранные образцы, перевязанные и снабженные этикеткой с необходимыми сведениями, должны сразу же поступать в лабораторию для подготовки к анализу.

Для уменьшения веса влитых растений каждое из них разре­зают вдоль на 2 части, одну из которых употребляют для анализа. Дальнейшее деление пробы допускается только после из­мельчения всех проб на отрезки длиной 1,5-2 см [12].

Подготовка проб кормовых растений к анализу

Так как одной из поставленных целей исследования является доказательство утверждения об использовании зеленой массы анализируемого растения в качестве корма или добавки в комплексе с зимними кормами, то целесообразно отразить в обзоре литературы общую характеристику подготовки проб кормовых растений к анализу.

Среднюю пробу растений, взятую в поле в тот же день, об­рабатывают в зависимости от целен изучения и предполагаемых анализов. Для химической оценки высушенных образцов (сена) по общему содержанию химических веществ срезанные растения в виде снопов (лучше в капроновой сетке) подвешивают на укрепленных жердях в крытых помещениях. Когда растения до­стигнут воздушно-сухого состояния, их помещают в марлевые мешки. Применение марлевых мешков необходимо для того, что­бы предупредить потерн листьев высушенных растений. Однако часто необходимо знать содержание сухих веществ в листостебельной массе; в этом случае взвешивают пробы (снопы) перед сушкой и после высушивания до воздушно сухого состояния и, определив содержание влаги в сене, вычисляют в исходном образце содержание сухих веществ в процентах.

Для анализа отдельных органов растения их сразу разделяют на части (работу ведут в тени) и каждую часть высушивают в марлевом мешке; стебли при этом лучше разрезать на части.

Для оценки химического состава растений в свежем виде взятые образцы (пробы) немедленно измельчают и приступают к их обработке, направленной к прекращению деятельности фер­ментов. Под влиянием различных ферментов в срезанных расте­ниях происходит распад белковых веществ, полисахаридов и дру­гих соединений, что не позволяет получить правильного представ­ления о первоначальном химическом составе взятых образцов.

Для этого измельченные на стеблерезке или другим путем пробы помещают рыхлым слоем в кюветы (эмалированные) или алюминиевые пластины и прогревают в стерилизаторном шкафу и здесь же высушивают. Можно обрабатывать также паром, поместив листостебельную массу в алюминиевых ситах (диаметр 18-20 см) на 10-15 мин над кипящей водой в большую кастрюлю. После этого потерявшую тур гор листостебельную массу высушивают в термостате (с вентиляцией или без нее).

Высушенные до воздушно-сухого состояния пробы листостебельной массы перед размельчением до необходимого помола подсушивают в течение 3-4 часов при 45° и еще в теплом состоя­нии размельчают на мельнице или мясорубке до грубого помо­ла затем отделяют часть последнего и размельчают до более тонкого помола на мельнице типа «Пируэт». Измельченный ма­териал хранят в стеклянных банках с пробкой или в пакетах из поливиниловой пленки в эксикаторах [20].

 

1.2. Методы определения содержания углеводов в растениях

Содержание углеводов и их разнообразие определяется видом растения, фазой развития, абиотическими факторами среды и изменяются в широких пределах. Определение углеводов в растительной продукции позволяет: установить закономерности обмена этих веществ; оценить качество зеленой массы, плодов, овощей и возможность их технической переработки; В здравоохранении составить энергетический баланс, в зоотехнии рассчитать пищевой рацион [25].

Существуют количественные методы определения моносахаридов: химические, поляриметрические. Определение полисахаридов в растениях осуществляется теми же методами, но прежде кислородная связь этих соединений разрушается в процессе гидролиза [19, 22].

В некоторых источниках указывается на цианидный метод, который является быстрым, простым с точки зрения используемых реактивов и при соблю­дении рекомендуемой техники анализа дает вполне удовлетвори­тельные результаты. Метод используют для определения сахаров в овощах, плодах и корнеплодах. Он основан на способности железосинеродистого калия (красной кровяной соли) в щелочной среде окислять редуцирующие сахара. Реакцию осуществляют путем титрования раствором исследуемого сахара кипящего щелочного раствора железосинеродистого калия в присутствии метиленовой сини в качестве индикатора. Содержание моносахаров (редуцирующих Сахаров) вычисляю по количеству титрованного раствора железосинеродистого калия и объему израсходованного на его титрование раствора сахара неизвестной концентрации [21, 6].

В практике широко используется определение углеводов по Бертрану. Растворимые углеводы извлекаются из растительного материала горячей дистиллированной водой. В одной части фильтрата определяют моносахариды, в другой – после гидролиза соляной кислотой ди- и трисахариды, которые распадаются при этом до глюкозы. Метод основан на способности моносахаридов, содержащих альдегидную группу, восстанавливать феллингову жидкость [18, 21, 22].

Отдельные авторы в своих работах указывают на определение углеводов фотометрически с пикриновой кислотой (модификация Соловьева). Моносахариды, имеющие альдегидную или кетонную группировку, могут восстанавливать динитросоединения, при этом образуются интенсивно окрашенные соединения. Окраска пропорциональна количеству углеводов в реакции, поэтому возможно их колориметрическое определение. В этом случае используют реакцию восстановления пикриновой кислоты (2,4,6-тринитрофенола) в пикраминовую [20].

К. П. Петров приводит определение редуцирующих сахаров (по Офнеру). С целью упрощения метода Офнер для определения редуцирующих веществ предложил раствор, в состав которого входит медный купорос, сегнетовая соль и карбонат натрия. Таким образом, в этом растворе концентрация ионов гидроксила понижена по сравнению с реактивом фелинга, и поэтому раствор хорошо сохраняется. Редуцирующие сахара окисляются несколько медленнее, чем с раствором фелинга. Однако, используя этот метод, не надо отфильтровывать Сu2О, так как его количество легко определяется иодометрическим титрованием.

Иодометрическим методом определяют оставшийся невосстановленный нон Сu²⁺ или непосредственно Сu2О. При этом используют ту же обратимую реакцию, только равновесие должно быть смещено влево. Весь Сu2О, перед окислением иодом, переводят в раствор, прибавляя достаточное количество НСl. Избыток иода оттитровывают раствором тиосульфата натрия и, таким образом (по разности), определяют количество иода, связанного Сu2О [17].

Для измерения количественного содержания дисахаридов (сахарозы) удобнее всего использовать оптический метод. Он основан на способности сахарозы в водных растворах вращать плоскость поляризации световых лучей [21].

1.3. Методы определения хлорофилла в растениях

Под названием хромопротеиды объединяют все цветные белки. Типичным представителем хромопротеидов является гемоглобин крови. Сходным по структуре с гемом гемоглобина крови и других сложных белков (ферментов) является хлорофилл растений, который связан также с белком.

Хлорофилл принадлежит к группе жирорастворимых пигментов, он растворяется в жирах и органических растворителях. Хлорофилл, как показали работы К. А. Тимирязева и его последователей, играет огромную роль в процессе ассимиляции углекислого газа. Процесс фотосинтеза представляет собой окислительно-восстановительное взаимодействие углекислого газа и воды, идущее в присутствии хлорофилла, который поглощает энергию солнечных лучей. Фотосинтез настоящее время является главным источником образования органических веществ на Земле.

К. П. Петров в своей работе «Методы биохимического анализа сырья» приводит метод определения хлорофилла по Т. Н. Годневу. Данный способ анализа заключается в выделении хлорофилла из зеленой части растения 96%-ным раствором этилового спирта и измерении оптической плотности вытяжки [17].

Также количественно хлорофилл можно определить с помощью методов хроматографии (по Сапожникову). Разделение смеси пигментов основывается на селектив­ной абсорбции фильтровальной бумаги. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется раствор, молеку­лы его разделяются на две фазы в соответствии с их коэф­фициентом разделения (подвижная и неподвижная фазы).

Чем больше растворимость пигмента в мобильной фазе, тем дальше он продвинется по хроматографической бумаге вместе с растворителем. В ходе исследования проводят такие операции, как экстракция, извлечение, элюация и количественное определение пигмента [4, 18].

В некоторых источниках подробно описывается спектрофотометрический метод количественного измерения этого хромопротеида. Спектрофотометрический анализ — наиболее точ­ный количественный метод определения содержания пигментов листа. Как и на фотоэлектроколориметре, концентрация пигментов на спектрофотометре опреде­ляется по оптической плотности. Однако в отличие от первого спектрофотометр позволяет выполнять анализ смесей веществ с близкими максимумами поглощения, что достигается за счет использования монохроматора, вследствие чего удается установить содержание хлороиллов и каротиноидов в вытяжке без предварительно­го разделения. Плотность экстракта на спектрофотомет­ре измеряют при длинах волн, соответствующих мак­симумам поглощения хлорофиллов а и b в красной об­ласти спектра и при длине волны абсорбционного мак­симума каротиноидов. При этом учитывают, что поло­жение максимума поглощения несколько меняется в за­висимости от используемого растворителя. Концентра­цию пигментов рассчитывают по уравнениям [4, 23].

Достаточно эффективно и удобно определение концентрации хлорофил­ла на фотоэлектроколориметре (ФЭКе). Для установления концентрации окрашенных растворов на фотоэлектроколориметре измеряют разность силы электрических токов, возникающих между двумя фото­элементами в результате неодинаковой интенсивности световых потоков, прошедших через растворитель и раствор [4, 23].

 

1.4. Методы качественного определения аскорбиновой кислоты в растениях

Качественные реакции на аскорбиновую кислоту (витамин С) основаны на его способности легко вступать в окислительно-восстановительные реакции и восстанавливать, например, метиленовую синь, 2,6-дихлорфенолиндофенол, гексациано-(III) феррат калия, нитрат серебра и др.

В литературе достаточно подробно описывается взаимодействие аскорбиновой кислоты с метиленовой синью, в ходе которого заранее обесцвеченный раствор метиленовой сини вновь приобретает синий цвет [8].

Протекающие при этом реакции можно представить схемами:

Аскорбиновая Анион аскорбиновой Дегидроаскорбиновая

кислота кислоты кислота

Метиленовый синий (окрашенная Метиленовый синий (бесцветная

окисленная форма восстановленная форма

При встряхивании обесцвеченного раствора метиленовой сини на воздухе протекает процесс:

Аскорбиновая кислота, окисляясь, восстанавливает гексациано-(III) феррат калия K3[Fe(CN)6] до гексациано-(II) феррата калия K4[Fe(CN)6], который с ионом железа в степени окисления +3 образует в кислой среде берлинскую лазурь:

берлинская лазурь

(синий осадок)

.

Многие авторы указывают на реакцию с 2,6-дихлорфенолиндофенолом.

К 1 мл сока прибавляют 1 мл 0,02%-ного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенол. Тщательно перемешивают, раствор обесцвечивается за счет образования лейкоформы индикатора. При дальнейшем прибавлении индикатора раствор окрашивается в розовый цвет, так как вся аскорбиновая кислота в пробе уже окислена и 2,6-дихлорфенолиндофенол больше не восстанавливается [10].

Реакция с раствором нитрата серебра.При этом происходит восстановление серебра, а аскорбиновая кислота окисляется в кетоформу. К извлечению прибавляют 1 мл раствора нитрата серебра, при этом выпадает осадок металлического серебра [8].

Реакция с солью железа (II) [8, 10].К 1 мл извлечения добавляют 1 мл раствора гидрокарбоната натрия и 1 мл сульфата железа (II). Наблюдают образование аскорбината железа фиолетового цвета:

.

1.5. Методы качественного определения некоторых биологически активных веществ растений

Определение алкалоидов

Метод Крафта. Метод Крафта может быть рекомендован в качестве полевого экспресс-метода для рекогносцировочной оценки растений на наличие алкалоидов.

а) Каплю свежевыжатого из растения сока наносят на фильтровальную бумагу, пропитанную реактивом Драгендорфа. При наличии алкалоидов в соке на бумаге появляется оранжевое пятно.

б) О наличии алкалоидов можно судить также по оранжевым пятнам, возникающим на местах соприкосновения свежего растения и бумаги при их сжатии. Для проведения анализа методом Крафта необходимо иметь щипцы для сдавливания и индикаторную бумагу, качество которой имеет решающее значение. Небольшой срез того или иного органа растения (лист, стебель, цветы) накладывают на полученную бумагу и с помощью плоскогубцев сдавливают. При наличии алкалоидов, выступивший при сжатии сок окрашивает бумагу в оранжево-красный цвет. При наличии хлорофилла оранжевое окрашивание наблюдается в виде каймы вокруг зеленого пятна

или в виде оранжево-красных участков между зелеными пятнами.

Определение алкалоидов методом извлечения. Растения грубо измельчают, помещают в пробирку, заливают 1% раствором соляной кислоты так, чтобы кислота покрывала весь материал (1:10) и нагревают до начала кипения.

До охлаждения жидкость фильтруют через фильтр и испытывают на присутствие в нем алкалоидов, для чего 1-2 капли фильтрата помещают при помощи стеклянной палочки на часовое стекло, рядом с ним наносят каплю реактива Вагнера и осторожно наклоняя стекло, обе капли соединяют. При слиянии капель, в случае присутствия алкалоидов жидкость мутнеет, а затем происходит выпадение трудно растворимых солей алкалоидов с реактивом Вагнера (осадок бурого цвета) [25, 23].

Определение сапонинов

Реакция пенообразования. Растение грубо измельчают и в пробирке готовят извлечение 1:10 на дистиллированной воде, фильтруют. В одну пробирку помещают 5 мл фильтрата, а в другую. 5 мл дистиллированной воды (контроль). Обе пробирки энергично встряхивают. Содержащие сапонины

настои при этом дают обильную пену, не исчезающую в течение длительного времени.

Реакция с раствором ацетата свинца. К 2 мл настоя прибавляют несколько капель ацетата свинца. Образуется осадок. Причем, терпеновые сапонины осаждаются средним ацетатом свинца, а стероидные - основным.

Реакция Лафона. К 2 мл водного настоя прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл этилового спирта и 10 капель 10% раствора сернокислого железа. При нагревании появляется сине-зеленое окрашивание [25].

 

 

Объект исследования

Эйхориия, водный гиацинт — Е. crassipes (Martius) Solms Laubach. Произрастает в прудах, озерах, болотах в тропических и субтропических районах Америки. Очень эффектное и необыкновенное по форме растение. Культивируют его в илистой почве или на поверх­ности воды. Образует розетку свое­образных листьев с оригинальными вздутыми, яйцевидной формы че­решками, играющими роль поплав­ков. Над поверхностью воды обра­зуются ложкообразные, гладкие, зе­леные листья с блестящей поверхностью и округлым основанием, к вершине овальнозауженные, по краям ровные, к поверхности воды нес­колько изогнутые, симметричные; продольные жилки листа просматри­ваются хорошо. Взрослые экземпля­ры растений несут до 10 листьев. Корневая система мочковатая, корни реснитчатые, хрупкие, темного цве­та. На цветоносе развиваются 5—12 цветков. Они собраны в колосовид­ные соцветия, напоминающие соцве­тия гиацинта, крупные, шестилепестковые, фиолетово-голубые, верхний лепесток окрашен более ярко и при­мерно в середине имеет темно-жел­тое пятно; тычинки фиолетового цве­та.

При благоприятных условиях это растение может образовать многочисленные побеги и быстро размно­житься. В естественных условиях гиацинт затягивает всю поверхность во­доема, вытесняя другие виды растений. Из пазух листьев могут отходить побеги, образующие новые растения.

Наилучшие условия содержания — небольшой уровень воды, верхнее освещение, наличие дневного света, чистая вода, оптимальная темпера­тура воды и воздуха летом 26°С, зи­мой 20—22°С; в зимнее время тре­буется дополнительное искусствен­ное освещение. Молодые растения зиму переносят легче, чем взрослые. Цветение отмечается в июле — ав­густе. Эйхорния может использовать­ся как естественный затенитель для других тенелюбивых растений [24].

Методы исследования

Углеводы, в частности альдозы, определялись иодометрическим методом (по Вильштеру и Шудлю). Тщательно измельченную навеску вещества (1г.) переносят в колбу емкостью 100 мл, растворяют в воде и доводят водой до метки. Затем содержимое колбы фильтруют или центрифугируют, из фильтрата в колбу Эрленмейера отбирают 10 мл раствора, что соответствует 0,1 г исходного вещества. В колбу добавляют 25 мл 0,1 н. раствора иода и через 2—З мин при энергичном помешивании медленно наливают 35 мл 0,1 н. раствора NаОН до исчезновения окраски иода. Колбу закрывают хорошо пригнанной резиновой или притертой стеклянной пробкой и ставят на 20 мин. в темное место. Затем колбу вынимают, добавляют в нее 1 н. раствора Н2SО4 и оттитровывают выделившийся иод 0,1 н. раствором Na2S2O3, добавляя к концу титрования раствор крахмала в качестве индикатора. Одновременно проводят контрольный опыт с 10 мл дистиллированной воды. Количество глюкозы (в %) при данном анализе вычисляют по формуле

R = (a-b) ×0,009×υ1×100/g×υ2

где а — количество раствора Na2S2O3, пошедшее на титрование в контрольном опыте; b — количество раствора Na2S2O3, пошедшее на титрование в рабочем опыте; 0,009 — титр глюкозы по иоду (молекулярная масса глюкозы 180, эквивалент 90, титр 0,1 н. раствора 0,009); υ1 - объем растворения навески; g — навеска; υ2 — объем, взятый для титрования [17]. Данный эксперимент проводился в пяти повторениях.

Для качественного определения содержания аскорбиновой кислоты использовались следующие методы.

Реакция с калия перманганатом [8]. К 1 мл реактива раствора перманганата калия по каплям добавляют извлечение из сырья, содержащее аскорбиновую кислоту. Наблюдают обесцвечивание раствора перманганата калия вследствие восстановления марганца до Mn ²⁺:

Реакция с раствором йода. К 1 мл реактива раствора йода по каплям добавляют извлечение из сырья, содержащее аскорбиновую кислоту. Наблюдают обесцвечивание раствора [8]:

Наличие следов алкалоидов определялось методом извлечения. Растения грубо измельчают, помещают в пробирку, заливают 1% раствором соляной кислоты так, чтобы кислота покрывала весь материал (1:10) и нагревают до начала кипения. До охлаждения жидкость фильтруют через фильтр и испытывают на присутствие в нем алкалоидов, для чего 1-2 капли фильтрата помещают при помощи стеклянной палочки на часовое стекло, рядом с ним наносят каплю реактива Вагнера и осторожно наклоняя стекло, обе капли соединяют. При слиянии капель, в случае присутствия алкалоидов жидкость мутнеет, а затем происходит выпадение трудно растворимых солей алкалоидов с реактивом Вагнера (осадок бурого цвета) [8].

Сапонины исследовались реакцией Лафона. К 2 мл водного настоя прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл этилового спирта и 10 капель 10% раствора сернокислого железа. При нагревании появляется сине-зеленое окрашивание [8].

Для получения вытяжки пигментов из высших растений навеску листьев массой до 0,5 г тщательно растирают в сухой фарфоровой ступке с небольшим количеством спирта. Ступку и пестик ополоснуть небольшим количеством растворителя. Измельчённый растительный материал фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Для окончательной экстракции пигмента общий объём экстракта в пробирке доводят до 5 мл. Для расчёта концентрации хлорофилла в вытяжке пигментов определяют оптическую плотность вытяжки на электрофотокалориметре при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения определяемых пигментов в данном растворителе: λ = 663, l кюв. = 1 см.

Х (%) = 1,3×m×100/V×D×l,

где Х (%) – содержание хлорофилла; m – масса навески, г; V – объем вытяжки, мл; D – оптическая плотность; l – толщина кюветы [23, 11].

Определение общей кислотности растения проводилось по следующей методике. Свежие или консервированные плоды, ягоды и овощи измельчают на терке и после тщательного перемешива­ния отвешивают на весах ВЛТК-500 в тарированной фарфоровой чашке 25 г мезги. Навеску без потерь смывают дистиллированное водой в мерную колбу вместимостью 250 см³. Удобнее всего поль­зоваться колбой Штифта. Объем жидкости в колбе доводят ди­стиллированной водой примерно до 150 см³ и колбу устанавливают в водяную баню, где температуру поддерживают на уровне 80°С.

Экстракцию органических кислот проводят выдерживанием колбы в водяной бане в течение 30 мин при перемешивании со­держимого колбы через каждые 5 мин. Затем содержимое колбы охлаждают (можно под струей холодной воды) и объем доводят до черты дистиллированной водой. Колбу закрывают пробкой, тщательно перемешивают содержимое и фильтруют через фильтр или вату; 50 см3 фильтрата пипеткой переносят в стакан или коническую колбу вместимостью 250—300 см³ и титруют в при­сутствии 3— 4 капель индикатора (фенолфталеина или комбини­ронянного) 0,1 н. раствором NaOH до изменения окраски. Фенол­фталеин при рН 8,2 изменяет окраску в фиолетовую, а смешанный индикатор при рН 7 дает фиолетово-синее окрашивание с переходом в зеленую при щелочной реакции титруемого раствора.

При титровании темноокрашенных растворов завершение тит­рования устанавливают по изменению окраски синей лакмусовой бумажки от капли титруемого раствора. Если лакмусовая бумага не окрасится в красный цвет от капли фильтрата, титрование считается законченным. В кислой среде синяя лакмусовая бу­мажка окрашивается в красный цвет.

Содержание органических кислот (в мг на 100 г плодов и ово­щей) находят по формуле:

X = a×T×6,7×V1 /H×V2,

где а - количество 0,1 н. щелочи на титрование, см³; Т — титр 0,1 н. щелочи; Н — навеска исследуемого материала, мг; V₁ — общий объем вытяжки, см³; V₂— объем фильтрата на титрование, см³; 6,7 — коэффициент для перевода кислот на яблочную. Для выражения кислотности в процентах расчет проводят по формуле:

X = a×T×0,0067×V1 ×100 /H×V2

Обозначения те же, за исключением того, что навеска вещест­ва, взятого для анализа, дана в г [21].

Было рассмотрено влияние стимуляторов роста растений на содержание альдоз (глюкозы) в Eichornia crassipes. В качестве стимулятора роста использовалась янтарная кислота. Растения в одинаковом количестве и одновременно обрабатывались стимулятором, параллельно фиксировались контрольные образцы. Действие янтарной кислоты длилось 45 дней, после чего проводилось иодометрическое определение альдоз (глюкозы) по Вильштеру и Шудлю, колориметрическое измерение оптической плотности окрашенного раствора хлорофилла на ФЭКе в контрольных образцах и изучаемых.

 

Eichornia crassipes.

Таким образом, среднее содержание органических кислот в пересчете на яблочную кислоту составляет 0,00185%.

3.3. Влияние стимуляторов роста растений (янтарной кислоты) на содержание хлорофилла в Eichornia crassipes

Изучение влияния стимуляторов роста растений (янтарной кислоты) на содержание хлорофилла проводилось в двух вариантах:

1) – без применения янтарной кислоты;

2) – с применением янтарной кислоты.

Вариант опыта	Масса навески, г	Объем вытяжки, мл	Толщина кюветы, см	Оптическая плотность	Содержание хлорофилла, %
1.	0,8855	5,6		1,4	29,483
2.	0,9313				25,030

 

Таблица 2.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биохимические методы анализа растений / М. Н. Запрометов [и др.]; под. ред. М. Н. Запрометова. – М.: Издательство иностранной литературы, 1960. – 592 с.

2. Благовещенский А. В. Биохимия растений / А. В. Благовещенский. – М.: Онти, 1934. – 459 с.

3. Дэвис Д. Биохимия растений / Д. Дэвис, Дж. Джованелли, Т. Рис. – М.: Мир, 1966. – 512 с.

4. Дука М. Физиология растений: практикум для студентов биолого-почвенного факультета / М. Дука, Т. Хоменко, Е. Савка. – Кишинэу: издательство Молдавского государственного университета, 2003. – 134 с.

5. Дурынина Е. П. Агрохимический анализ почв, растений, удобрений / Е. П. Дурынина, В. С. Егоров. – М.: МГУ, 1998. – 113 с.

6. Иванов Н. Н. Методы физиологии и биохимии растений / Н. Н. Иванов. – М-Л.: Огиз, 1946. – 493 с.

7. Кизель А. Р. Практическое руководство по биохимии растений / А. Р. Кизель. – М-Л.: Биомедгиз, 1934. – 311 с.

8. Коренская И. М. Лекарственные растения и лекарственное растительное сырье, содержащее витамины, полисахариды, жирные масла: учебно-методическое пособие для самостоятельной работы студентов фармацевтического факультета / И. М. Коренская, И. П. Ивановская, О. А. Колосова. – Воронеж: издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2008. – 85 с.

9. Лагунов А. Г. Регуляторы роста растений / А. Г. Лагунов. – М.: Агропромиздат, 1982. – 342 с.

10. Методические указания к агрохимическому анализу растений для студентов / А. А. Гапиенко [и др.]; под. ред. А. А. Гапиенко. – Симферополь: издательство Крымского государственного аграрного университета, 2000. – 32 с.

11. Методы биохимического анализа растений / В. В. Полевой [и др.]; под. ред. В. В. Полевого, Г. Б. Максимова. – Л.: издательство Ленинградского университета, 1978. – 192 с.

12. Методы биохимического исследования растений / А. И. Ермаков [и др.]; под. ред. А. И. Ермакова. – Л.: Агропромиздат. Ленинградское отделение, 1987. – 430 с.

 

13. Мотылев, С. Водный гиацинт в гептиловом болоте / А. Ермаков, С. Мотылев // Химия и жизнь. 2002. №11.С. 46-49.

14. Муравин Э. А. Агрохимия / Э. А. Муравин. – М.: Колос, 2003. – 384 с.

15. Рыженко, Б. Ф. Информационный обзор способа очистки (доочистки) вод с применением Эйхорнии (Водного гиацинта) / Б. Ф. Рыженко // Кавказская здравница. 1991. №6. С. 15-19.

16. Пестициды и регуляторы роста растений: справочник / Н. Н. Мельников [и др.]. – М.: Химия, 1995. – 575 с.: ил.

17. Петров К. П. Методы биохимии растительных продуктов / К. П. Петров. – Киев: Вища школа, 1978. – 224 с.

18. Плешков Б.П. Биохимия сельскохозяйственных растений / Б. П. Плешков. – М.: Агропромиздат, 1987. – 494 с.

19. Починок Х. Н. Методы биохимического анализа растений / Х. Н. Починок. – Киев: Наукова Думка, 1976. – 335 с.

20. Практикум по агрохимии / В. Г. Минеев [и др.]; под. ред. В. Г. Минеева. – М.: издательства МГУ, 2001. – 689 с.

21. Практикум по агрохимии / И. П. Дерюгин [и др.]; под. ред. Б. А. Ягодина. – М.: Агропромиздат, 1987. – 512 с.

22. Практикум по биохимии растений / В. В. Полевой [и др.]; под. ред. В. В. Полевого, С. М. Щипарева. – С-Петербург.: издательство СПБ университета, 1996. – 200 с.

23. Практикум по физиологии растений / Н. И. Третьяков [и др.]; под. ред. Н. И. Третьякова. – 3-е изд. перераб. и доп. – М.: Агропромиздат, 1990. – 271 с.: ил. – (Учебники и пособия для студентов высших учебных заведений).

24. Тахтаджян А. Л. Жизнь растений: в 6 т. / А. Л. Тахтаджян. — М.: Просвещение, 1982. Т. 6: Цветковые растения. — 1982. — 543с.

25. Химический анализ лекарственных растений / Е. Я. Ладыгина [и др.]; под. ред. Н. И. Гринкевича, Л. Н. Сафровича. – М.: Высшая школа, 1983. – 176 с.

 

 

Приложение 1

ВВЕДЕНИЕ

Последнее время для биологической очистки водоемов применяется гидробионт Eichornia crassipes. Очищая стоки от вредных примесей, растение в себе их не накапливает, а "съедает", при этом активно вегетирует. Чем грязнее водоем, тем быстрее оно растет и размножается [13]. Если вода очистилась и питаться нечем, Эйхорния начинает перерабатывать доступный придонный ил. Во избежание этого нами предлагается использование зеленой массы данного растения как в качестве корма или добавки в комплексе с зимними кормами. Тем самым решаются проблемы: выведения из пищевой цепи посевных площадей, обеднения почв, повышения конечной стоимости продуктов питания. Следует отметить, что 1га Эйхорнии экономит 8-10 га посевных площадей [15].