ТОП 10:

Методы исследования мембранных структур



[7]

 

Дифракция рентгеновских лучей. [A18]

Этот метод в применении к изучению высокоупорядоченных кристаллических образований позволяет с высоким разрешением получать информацию о структуре. В случае малоупорядоченных препаратов возможности этого метода ограничены. Некоторые специализированные мембранные системы имеют регулярную структуру, поэтому их можно изучать рентгеноструктурными методами. Наиболее распространенным примером такого рода служит миелиновая оболочка, которая многократно оборачиваясь вокруг аксона, формирует регулярную систему из концентрических мембранных структур. [A19]

Исследования дифракции рентгеновских лучей на миелине, проведенные еще в 1930 г., подтверждают адекватность бислойной модели мембран. К такому же выводу приводит и изучение наружного сегмента палочек сетчатки позвоночных, которые представляют собой упорядоченные диски. [A20]

Этот метод применим и для изучения искусственно упорядоченных систем, которые образуются при коллапсировании в условиях центрифугирования мембранных везикул, полученных из митохондрий и эритроцитов. Однако рентгеноструктурные данные, полученные для разных мембран, различаются лишь незначительно, несмотря на большие различия в содержании белка (от 20 до 80%). [A21]

Хотя рентгеноструктурные данные позволяют получить некоторую информацию о том, как расположена в мембране основная масса мембранных белков (интегральных или периферических), в целом метод рентгеноструктурного анализа не дает детальной молекулярной картины. [A22]

 

В 1971 г. М. Уилкинс и соавторы показали, что метод дифракции рентгеновских лучей применим и для изучения водных дисперсий мембран и фосфолипидов. И в этом случае мембранные препараты, полученные из разных источников, дали сходную дифракционную картину, что подтверждает универсальность бислойной модели. [A23]

Этот метод может быть весьма полезен при исследовании упорядоченных липидно-водных систем, но невозможность получения детальной молекулярной картины с его помощью ограничивает его использование для изучения биологических мембран. [A24]

Электронная микроскопия [A25]

 

[A26]

 

Просвечивающая электронная микроскопия тонких срезов миелина, как и многих других мембранных структур, выявляет характерную картину, состоящую из двух электроноплотных полос, разделенных промежутком около 8 нм[A27] (рис. 807251732).

 

 

Рис. 807251732. Просвечивающая электронная микроскопия тонких срезов миелина. [A28]

 

Такая картина получается в результате обработки мембранных препаратов четырехокисью осмия, обычно применяемой в этом методе.

Дж. Робертсон назвал наблюдаемую картину «унитарной», чтобы подчеркнуть её универсальность, и хотя молекулярные механизмы прокрашивания мембран осмием до сих пор не известны, эта структура долгое время рассматривалась как основное подтверждение справедливости бислойной модели мембраны.

Однако в этом методе есть существенный артефакт – при подготовке препаратов для анализа мембраны подвергаются неблагоприятным воздействиям. Обработка четырехокисью осмия приводит к значительной потере белка из эритроцитарной мембраны. И хотя наблюдаемая при этом трехслойная структура до некоторой степени отражает организацию бислойных мембран, более детальные сведения относительно локализации белков в мембране этим методом получить не удается.

Методы замораживания-скалывания, замораживания-травления [A29]

Некоторую информацию о расположении мембранных белков дали новые электронно-микроскопические методы, ставшие теперь уже классическими – методы замораживания-скалывания и замораживания-травления. В этом случае препараты быстро замораживают, не подвергая их каким-либо повреждающим действиям.

1. После замораживания образец, представляющий собой суспензию клеток или мембран, скалывают с помощью ножа при низкой температуре (–1000ºС) в глубоком вакууме. При этом мембрана раскалывается по своей срединной области и расщепляется на две половинки. В результате на образовавшихся плоскостях скола обнажается внутренняя область мембраны.

2. При необходимости образец подвергают травлению – проводят обычную возгонку льда в вакууме. Это позволяет лучше визуализировать поверхностные структуры клеточных мембран.

 

 

 

 

[A30]

 

Процесс подготовки препарата включает следующие операции (рис. 32):

 

 

Рис. 32. Исследование мембран методом замораживания-скалывания. А – плоскость скола замороженной клетки частично проходит через центральную часть различных мембран. Б – разъединение двух половинок. В – образец подвергают травлению для выявления деталей поверхности слоя. Г – на образец напыляют слой платины, а затем слой углерода получая реплику с поверхности образца. Д – эту реплику отделяют от препарата и исследуют под электронным микроскопом.

 

 

 

 

Рис.3 Микрофотография мембраны приготовленной методом замораживания-скалывания. При этом мембрана раскалывается на две поверхности: P-поверхность – гидрофобная часть внутреннего слоя мембраны, Е-поверхноть – гидрофобная часть внешней половины бислоя. На микрофотографии видны отверстия от интегральных белков, оставшиеся при скалывании. Сами белки остались на другой половине липидного бислоя. [Rees, 1996] [A31]

 

 

 

Наиболее характерные структуры, наблюдаемые при изучении мембран методом замораживания – скалывания, – это многочисленные внутримембранные частицы диаметром от 8 до 10 нм, лежащие в плоскости мембранных сколов. [A32]

Обычно они расположены хаотично, но иногда образуют группы. Вероятнее всего, эти частицы являются мембранными белками. При электронной микроскопии тонких срезов подобные структуры не обнаруживаются. [A33]

Реплики, полученные от двух половинок расщепленной мембраны, не всегда топологически комплементарны. Это означает, что некоторые частицы связаны только с одной из половин мембраны. [A34]

Данные, полученные методом замораживания-скалывания, широко использовались С. Сингером и Дж. Никольсоном при создании жидкостно-мозаичной модели мембран, поскольку они убедительно показывали, что глобулярные белки находятся не только на поверхности мембраны, но и внутри бислоя (!!!). [A35]







Последнее изменение этой страницы: 2017-02-19; Нарушение авторского права страницы

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 34.204.169.76 (0.012 с.)