Исследование профилей экспрессии генов микрорнк у пациентов со светлоклеточным раком почки.

КЛИМЕНТОВА Е.А., ГИЛЯЗОВА И.Р., КУНСБАЕВА Г.Б., СУЛТАНОВ И.М., ИЗМАЙЛОВ А.А., ПАВЛОВ В.Н., ХУСНУТДИНОВА Э.К.

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК, Г. УФА

Цель: Провести анализ экспрессии 758 зрелых микроРНК в опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхиме пациентов со светлоклеточным раком почки.

Методы: Выделение тотальной РНК и микроРНК проводилось с помощью набора Invitrogen/Ambion Kit. Обратная транскрипция проводилась с помощью специфичных к микроРНК праймеров Megaplex Primer Pools (Life Technologies) и набора Human TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies). Анализ экспрессии микроРНК проводился с помощью технологии OpenArray использованием QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System. Анализ экспрессии микроРНК был проведен на 6 образцах нормальной почечной паренхимы и 18 образцах опухолевой ткани почки пациентов с раком почки с гистологической верификацией морфологии ткани и диагнозом «светлоклеточный рак почки» с использованием слайдов TaqMan OpenArray MicroRNA Panel, содержащих уникальные TaqMan пробы на 758 микроРНК.

Результаты: Проведенный анализ экспрессии 758 микроРНК у пациентов с раком почки после введения поправки на множественность (FDR) выявил всего 2 дифференциально экспрессирующихся микроРНК между нормальной почечной паренхимой и опухолевой тканью почки светлоклеточного гистологического варианта – miR-210 и miR-642. Для валидации данных, полученных при массовом скрининге микроРНК, была собрана отдельная независимая группа пациентов, отобраны образцы тканей (15 образцов нормальной и 15 образцов опухолевой ткани почки) и проведен анализ экспрессии микроРНК-210 и микроРНК-642. В результате такого анализа обнаружен статистически значимый высокий уровень экспрессии микроРНК-210 в опухолях почки (M±SEM: 3,48±0,159) по сравнению с нормальной почечной паренхимой (M±SEM: 2,6±0,253).

Обсуждение: Исследования последних лет демонстрируют влияние тканевой гипоксии на экспрессию miR-210. МикроРНК-210 (miR-210) является наиболее часто активируемой микроРНК в нескольких раковых клеточных линиях в условиях гипоксии. Она активируется во многих типах опухолей, предположительно, из-за гипоксического характера опухолей, поскольку нарушенный ангиогенез не способен поддерживать адекватное кровоснабжение при развитии заболевания. Опухолевая гипоксия коррелирует с худшим ответом на лучевую и химиотерапию, неблагоприятным исходом. Кроме того, при изучении метастатического рака почки показано, что снижение экспрессии микроРНК-210 способствует уменьшению миграции и инвазии опухолевых клеток.

Выводы: Полученные данные позволяют предположить, что изменение экспрессии генов микроРНК может вносить вклад в генетическую предрасположенность рака почки и служить диагностическим маркером развития данного заболевания.

ИЗУЧЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ МУЛЬТИМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДРОЖЖЕВОГО БЕЛКА NHP6 СО СВОБОДНОЙ И НУКЛЕОСОМНОЙ ДНК

КОЗЛОВА А.Л., ГЕРАСИМОВА Н.С., ВАЛИЕВА М.Е., СТУДИТСКИЙ В.М.

МГУ ИМ.М.В.ЛОМОНОСОВА, МОСКВА

Цель: Nhp6 – это небольшой белок дрожжей с молекулярной массой 10,81 кДа, неспецифично связывающий ДНК. Этот белок присутствует в большом количестве в ядре дрожжей и входит в состав нескольких комплексов (к примеру, комплекса FACT), взаимодействующих с хроматином и играющих жизненно важную роль в метаболизме клетки. Однако механизм взаимодействия Nhp6 с нуклеосомой в биологических процессах до сих пор недостаточно изучен. Целью работы было выяснить, отличается ли связывание Nhp6 со свободным фрагментом ДНК длиной 282 п.н. и с собранной на нём мононуклеосомой.

Методы: Исследуемые ДНК-фрагменты были получены методом полимеразной цепной реакции и очищены в агарозном геле. В ходе ступенчатого диализа против растворов с понижающейся ионной силой в присутствии донорного хроматина на них были собраны мононуклеосомы. ДНК или нуклеосомы инкубировали в различных условиях в присутствии разных количеств белка Nhp6, образование ДНК-белковых комплексов наблюдали за счет сдвига электрофоретической (ЭФ) подвижности в нативном полиакриламидном геле (ПААГ).

Результаты: В нашей работе мы получили ДНК, содержащую высокоаффинную к гистонам последовательность нуклеотидов 603 для посадки нуклеосомы и промоторный участок для транскрипции in vitro модельной РНК-полимеразой E. сoli. Мы определили, что при взаимодействии Nhp6 с одним и тем же фрагментом ДНК в свободном и связанном с гистоновым октамером виде наблюдается формирование одинакового количества комплексов, отличающихся по ЭФ подвижности в нативном ПААГ. При постепенном повышении концентрации белка было выявлено последовательное образование восьми мультимолекулярных комплексов. Каждый такой комплекс состоит из одного ДНК-содержащего субстрата и некоторого количества молекул Nhp6. При образовании восьмого комплекса наблюдается насыщение связывания, причем в случае свободной ДНК это происходит при меньшей концентрации белка. Кроме того, было показано, что при повышении ионной силы раствора образование мультимолекулярных комплексов проходит более эффективно, чем при низкой ионной силе, и, как следствие, насыщение комплекса происходит при более низких концентрациях.

Обсуждение: Методом наблюдения за ЭФ подвижностью ДНК-белковых комплексов в нативном ПААГ мы определили, нуклеосомная организация не влияет на количество молекул Nhp6, которые могут связаться с ДНК. Из данных литературы известно, что белок Nhp6 связывается с участком ДНК длиной 10-15 п.н.. Поскольку в среднем на молекулу Nhp6 приходилось 35 п.н., скорее всего, молекулы Nhp6 могут одновременно связываться только на некотором расстоянии друг от друга вдоль спирали ДНК.

Выводы: 1. Как свободная, так и нуклеосомальная ДНК длиной 282 п.н. образуют с белком Nhp6 восемь комплексов, отличающихся по подвижности в нативном ПААГ. 2. В среднем на один связанный комплекс Nhp6 с ДНК приходилось 35 п.н. 3. Нуклеосомная организация снижает сродство Nhp6 к ДНК.