Соотношение экспрессии протеаз в тучных клетках желудка монгольских песчанок после орбитального полета

АТЯКШИН Д.А., БУРЦЕВА А.С., ЦВЕТИКОВА Л.Н.

ФГБОУ ВО ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Н.БУРДЕНКО МИНЗДРАВА РФ,

НИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ

 

Цель: определение протеазного профиля популяции тучных клеток (ТК) желудка монгольских песчанок после орбитального полета.

Методы: Изучены монгольские песчанки Meriones unguiculatus трёх экспериментальных групп: биологического контроля (n=12), синхронного эксперимента по моделированию некоторых условий космического полета в макете полетной аппаратуры «Контур-Л» в наземных условиях (n=11) и группы животных, перенесших 12-суточный орбитальный полет на космическом аппарате «Фотон-М» №3 (n=12). Фрагменты желудка фиксировали в нейтральном формалине, заливали в парафин и на гистологических срезах выявляли тучные клетки. Триптазу идентифицировали иммуногистохимическим маркированием мышиными моноклональными антителами (Anti-Mast Cell Tryptase antibody, AbCam, #ab2378, разведение 1:2000) согласно стандартному протоколу (Buchwalow I.B., Boecker W., 2010). Гомологичные мышиные иммуноглобулины блокировались неконъюгированными Fab-фрагментами. Химаза выявлялась кроличьими биотинилированными антителами (Mast cell Chymase Antibody, Biotin Conjugated, Bioss, #bs-2353R-Biotin, разведение 1:500). Для светлопольной микроскопии связанные первичные антитела детектировали с помощью ферментной метки (пероксидаза хрена), срезы докрашивали гематоксилином Майера. При множественном иммуномаркировании антитриптазные первичные антитела визуализировали с помощью козьих вторичных антител, конъюгированных с флюорохромом Су3 (CyTM3-conjugated Affin Pure Goat Anti Mouse IgG, #115-165-166). Антихимазные антитела идентифицировали стрептавидином (Streptavidin Alexa Fluor 488, # S11223). Ядра контрастировали красителем DAPI. ТК, локализованные в слизистой оболочке (мукозная субпопуляция) и в подслизистой, мышечной и серозной оболочках (соединительнотканная субпопуляция) анализировали раздельно. Количественное содержание ТК выявляли в перечете на поле зрения с помощью микроскопа Zeiss Axio Imager A2 при использовании объектива х20.

Результаты: после космического полета происходило снижение абсолютного объема популяции ТК в желудке, как в мукозной, так и соединительнотканной субпопуляциях. В протеазном профиле популяции ТК возрастало относительное содержание химаза-позитивных элементов, а также ТК с одновременной экспрессией триптазы и химазы. Вместе с этим, происходило снижение количества триптаза-позитивных ТК. Выявленные изменения содержания протеаз наблюдалось как в слизистой, так и других оболочках желудка.

Обсуждение и выводы: принимая во внимание биологические эффекты триптазы на матриксные металлопротеиназы, проколлагеназу, высвобождение и расщепление фибронектина, коллагена IV типа, биосинтетическую активность фибробластов и др. очевидна активная роль тучных клеток в адаптации к условиям невесомости, которая проявляется, в т.ч., процессами ремоделирования внеклеточного матрикса соединительной ткани. Возрастание уровня химазы в протеазном профиле популяции тучных клеток следует расценивать как значимое событие не только с точки зрения состояния компонентов внутриорганной соединительной ткани, но и механизмов формирования артериального давления в условиях с измененной гравитацией.

 

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ACTB, GAPDH, HPRT1, SCARNA5, RNU12, RN7SL1 И RNA5-8S5 В ОПУХОЛЕВОЙ И МОРФОЛОГИЧЕСКИ НЕИЗМЕНЕННОЙ ТКАНИ

БАБЕНКО А.С.*, СМИРНОВ С.Ю., СТУПАК Д.С., СТАТКЕВИЧ Л.В., СМОЛЯКОВА Р.М.

РЕСПУБЛИКАНСКИЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР ОНКОЛОГИИ И МЕДИЦИНСКОЙ РАДИОЛОГИИ ИМ. Н.Н. АЛЕКСАНДРОВА,

МИНСК, БЕЛАРУСЬ

*[e-mail]

 

Цель: изучить стабильность экспрессии классических референсных генов и нескольких длинных некодирующих РНК в опухолевой и морфологически неизмененной ткани.

Методы: в исследование включены 32 образца опухолевой ткани кишечника, 32 образца опухолевой ткани желудка, по 32 образца морфологически неизмененной ткани кишечника и желудка. Общую фракцию РНК выделяли с использованием набора реагентов «RNAqueous - 4PCR kit» (Амбион, США) из образцов нативной ткани (-70оС). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, США). ПЦР в режиме реального времени в формате TaqMan проводили с использованием набора реагентов Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase (Fermentas, Литва). Качественные и количественные характеристики РНК оценивали с использованием спектрофотометрии и агарозного ель-электрофореза. Дополнительная обработка образцов ДНКазой не проводилась. Амплификацию проводили на оборудовании CFX-96touch (Bio-Rad, США).

Результаты: анализ показал, что в ткани кишечника наиболее стабильно экспрессируются гены – RNU12 и GAPDH, а в ткани желудка – HPRT1, SCARNA5 и RNU12. Также показано, что при комплексном анализе тканей наиболее стабильный уровень экспрессии характерен для генов GAPDH, ACTВ и HPRT1. Стабильность экспрессии исследуемых референсных генов в опухолевой ткани несколько ниже, чем в морфологически неизменённой.

Выводы: в отдельно взятых случаях использование малых некодирующих РНК, в частности SCARNA5 и RNU12 может быть более оправдано, нежели кодирующих белок классических референсных генов. Тем не менее, критическим моментом выбора референсного гена при проведении и планировании любого эксперимента является тщательный предварительный анализ стабильности широкого круга генов, включающего как классические, так и инновационные решения.