Роль рнк-связывающего белка orb2 в поляризации клеток дрозофилы

ГИЛЬМУТДИНОВ Р.А.¹, КОЗЛОВ Е.Н.¹, ЯКОВЛЕВ К.В.¹, ШЕДЛ П.^1,2, ШИДЛОВСКИЙ Ю.В.¹

 

¹ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РАН, МОСКВА

²PRINCETON UNIVERSITY, ПРИНСТОН, НЬЮ ДЖЕРСИ, США

Поляризация клеток – важный биологический процесс, позволяющий клеткам дифференцироваться, формировать ткани, сложные структуры более высокого порядка, такие как органы и, в конечном итоге, специфический план строения тела каждого многоклеточного организма. Многочисленные исследования показывают, что механизм создания, а в дальнейшем и поддержания полярности клеток связан с асимметричной локализации белков в ней, что в свою очередь определяется специфической локализацией мРНК. Все процессы, связанные с мРНК, контролируются набором факторов, которые последовательно связываются с этой молекулой.

Одним из таких факторов у дрозофилы является РНК-связывающий белок ORB2 из семейства CPEB белков – трансляционных регуляторов, которые способны либо активировать, либо подавлять трансляцию специфических мРНК. СPEB белки связывают СPE сайты целевых мРНК в 3’-нетранслируемой области. Исследования последних лет показали связь локализации различных мРНК с функционированием ORB2. Было также показано, что ORB2 способен контролировать локализацию своей собственной мРНК посредством связывания через ее CPE сайт.

Цель: В связи с вышеупомянутым была поставлена цель создать мутантную линию мух Drosophila melanogaster c отсутствующим СPE сайтом для изучения роли ORB2 в поляризации клеток.

Методы: Целевое редактирование генома дрозофилы стало возможным благодаря новой генно-инженерной технологии - CRISPR

Результаты: После селекции мутантных трансформантов по специфическому маркеру, введенному в геном с помощью CRISPR и последующих скрещиваний с балансерными линиями удалось получить стабильные линии мутантов дрозофилы по ORB2. Эффективность целевого редактирования генома была подтверждена молекулярно-биологическими методами: ПЦР, ПЦР в реальном времени, секвенирование.

Обсуждение: Предыдущие работы хорошо зарекомендовали семенники как модельные системы для изучения РНК-связывающих функций ORB2 в дрозофиле, поскольку развивающиеся сперматозоиды обладают ярко выраженной асимметрией и повышенным уровнем экспрессии этого белка в них. В прошлых исследованиях было показано, что на стадии сперматид ORB2 локализуется на кончиках, вместе с ним со-локализуются некоторые его мРНК мишени, в том числе своя собственная мРНК. Различные мутанты по ORB2 обычно дают фенотип с нарушением нормального созревания сперматозоидов и с изменением в локализации целевых мРНК. На данный момент в нашей мутантной линии в 90% случаев выявлены нарушения созревания сперматозоидов на поздних стадиях развития.

Выводы: На основе первичных данных по фенотипу наших мутантов, полученных с помощью CRISPR, можно сделать предположение, что ORB2 действительно регулирует локализацию своей мРНК, а нарушения его собственной локализации повлекут нарушения в локализации других целевых мРНК, о чем должны показать дальнейшие исследования.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 16-34-60214.

ЭКСПРЕССИЯ ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ В ФИБРОБЛАСТАХ ДЕРМЫ

ЧЕЛОВЕКА В ОНТОГЕНЕЗЕ

ГОЛУБЦОВА Н.Н.*, ФИЛИППОВ Ф.Н., ГУНИН А.Г.

ФГБОУ ВПО «ЧУВАШСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ И.Н.УЛЬЯНОВОЙ»

*[e-mail]

Цель: определение уровня экспрессии ламинов А, В1, В2 и ламин ассоциированного полипептида-2-альфа (LAP-2α) в фибробластах и процента положительно окрашенных фибробластов в дерме человека в возрастном аспекте.

Методы: исследования проводились с применением непрямого иммуногистохимического метода. Было использовано 112 образцов кожи, которые разделили на 5 возрастных групп: 1 группа – 20-40 недель беременности, 2 группа – 0-20 лет, 3 группа – 21-40 лет, 4 группа – 41-60 лет, 5 группа – 61-85 лет. По каждой группе данных рассчитывали средние арифметические величины (М) и их стандартные ошибки (m). Достоверность влияния возраста и пола на исследуемые параметры кожи оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Взаимосвязи между возрастом и параметрами кожи оценивали с применением непараметрического рангового корреляционного анализа Спирмена. Корреляционный анализ проводили без разделения данных на возрастные группы. Достоверными считали отличия при р<0,05.

Результаты: Было установлено, что процент фибробластов, содержащих ламин А и В2, планомерно уменьшался с возрастом, при этом уровень экспрессии ламина А и В2 в ядрах фибробластов практически не изменялся. В период от 20 до 40 недель беременности было выявлено 62,3% фибробластов с положительной окраской на ламин В1. Их содержание и уровень экспрессии ламина В1 уменьшались от 0-40 лет, а затем снова увеличивались в период от 41 года до 85 лет. Процент фибробластов с положительной окраской на LAP-2α увеличивался с возрастом. Содержание LAP-2α в ядрах фибробластов уменьшалось от 0 до 20 лет, а после 21 года постепенно увеличивалось. Общее число фибробластов и PCNA-положительных фибробластов в дерме уменьшалось с возрастом. Наиболее значительное снижение числа фибробластов отмечено на протяжении от 20 недель беременности до 20 лет.

Обсуждение: на сегодняшний день имеются свидетельства важного участия ламинов в деятельности клеточного ядра: организации гетерохроматина, трехмерной конформации генома и т.д. Изменения экспрессии ядерных ламинов, доли иммунопозитивных к ламинам фибробластов и ассоциированных с ними белков, установленные в настояшей работе, имеют возрастзависимый характер. Это обстоятельство позволяет предположить, что ламины и ассоциированные с ними белки могут оказывать влияние на процессы пролиферации и дифференцировки фибробластов кожи в онтогенезе и, как следствие, на обеспечение физиологических функций и возрастные изменения кожи.

Выводы: Результаты работы позволяют предположить участие ядерных ламинов и LAP-2α в возрастном уменьшении численности фибробластов в дерме человека.

Работа поддержана грантом РФФИ 16-44-210018.