Правила работы в микробиологической лаборатории

Основные правила работы в базовой лаборатории включают:

• запрет работ с пипеткой при помощи рта;

• запрет приема пищи, питья, курения, хранения пищи и применения косметических средств в рабочих помещениях;

• поддержание чистоты и порядка;

• дезинфекцию рабочих поверхностей не реже 1 раза в день и после каждого попадания на них заразного материала;

• мытье рук персоналом после работы с заразным материалом, животными, перед уходом из лаборатории;

• проведение всех работ таким образом, чтобы свести к минимуму возможность образования аэрозоля;

• обеззараживание всех инфицированных материалов перед выбросом или повторным использованием.

Антигены понятие химическая структура

10.

11.

Специфичность – структурные особенности, отличающие один антиген от другого.

Способность вызывать развитие иммунного ответа и определять его специфичность обладает фрагмент молекулы антигена – антигенная детерминанта (эпитоп), избирательно реагирующая с антигенраспознающими рецепторами и антителами. Молекула антигена может иметь несколько эпитопов, то есть быть поливалентной. Чем сложнее молекула антигена и чем больше у нее эпитопов, тем больше вероятность развития иммунной ответа.

Структура, обладающая индивидуальной антигенной специфичностью, называется антигенным детерминантом, или эпитопом. Последнее название отражает то, что антигенной активностью обладают только структуры лежащие на поверхности молекулы, а глубокие проявляют антигенность лишь при изменении конформации или разрушении молекулы. Разнообразие белковых эпитопов достигается за счет мозаики аминокислотных остатков, расположенных на глобулярной поверхности молекулы белка. Специфичность определяют структурные особенности антигена, в частности структура антигенной детерминанты, или эпитопа. Практически в любой молекуле антигена есть несколько антигенных детерминант, или эпитопов, определяющих ее специфичность. Иммунная система через TCR или антитело распознает не весь антиген, а часть молекулы, определяемую как доминантный эпитоп.

12.

 

Персистенция, вирусная персистенция - сохранение вируса в функционально активном состоянии в клетках организма или культур ткани за пределами тех сроков, которые характерны для острой инфекции.

Механизмы персистенции антигенов в организме:

Пути проникновения:

В результате фагоцитоза, через поврежденный эпителий, через цитоплазму эпителиальных клеток, через ходы в эпителии.

Локализация:

Аккумуляция в местах максимального скопления макрофагов(печень,почки, костный мозг, селезенка)

Аккумулируются в регионарных лимфатических узлах.

В слизистой оболочке.

Элиминация антигенов:

1 фаза- диффузия растворимого аг и его распределение в сосудистом русле и тканях.

2 фаза- ферментативное расщепление аг.

3 фаза- иммунная элиминация.

13.

Механизмы врожденного иммунитета:

Врождённый иммунитет - наиболее ранний защитный механизм как в эволюционном плане (он существует практически у всех многоклеточных), так и по времени ответа, развивающегося в первые часы и дни после проникновения чужеродного материала во внутреннюю среду, т.е. задолго до развития адаптивной иммунной реакции. Значительную часть патогенов инактивируют именно врождённые механизмы иммунитета, не доводя процесс до развития иммунного ответа с участием лимфоцитов. И только если механизмы врождённого иммунитета не справляются с проникающими в организм патогенами, в «игру» включаются лимфоциты. При этом адаптивный иммунный ответ невозможен без вовлечения механизмов врождённого иммунитета. Кроме того, врождённый иммунитет играет главную роль в удалении апоптотических и некротических клеток и реконструировании повреждённых органов. В механизмах врождённой защиты организма важнейшую роль играют первичные рецепторы для патогенов, система комплемента, фагоцитоз, эндогенные пептиды-антибиотики и факторы защиты от вирусов - интерфероны.

14-15

Антигенпредставляющие клетки или антигенпрезентирующие клетки (АПК, англ. antigen-presenting cell, APC) — клетки, которые экспонируют чужеродный антиген в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (англ. MHC) на своей поверхности. Т-лимфоциты могут распознавать такие комплексы при помощи Т-клеточных рецепторов (англ. TCR). Антигенпредставляющие клетки процессируют антиген и представляют его Т-клеткам. основные антигенпрезентирующие клетки: макрофаги, дендритные клетки, В-лимфоциты.

Процессы переработки и презентации антигенных пептидов природы антигенов: эндогенных (вирусы, внутриклеточные бактерии, опухоли, в том числе аутоантигены, и др.) и экзогенных (микроорганизмы, токсины, аллергены, разнообразные белки и др.).

Эндогенные антигены после ферментативной деградации в протеасоме транспортируются в эндоплазматический ретикулум с участием переносчиков ТАР-1 и ТАР-2, где образуют комплекс с молекулой HLA класса I» синтезируемой в ретикулуме. Затем комплекс с помощью транспортной системы аппарата Гольджи транспортируется на клеточную поверхность АПК и презентируется CD8+ Т-лимфоцитам.

Экзогенные пептиды презентируются в комплексе с молекулами HLA класса II. В эндоплазматическом ретикулуме синтезируются молекулы HLA класса II, которые вначале стабилизируются с помощью шаперона калнексина, а затем с помощью инвариантной цепи. Фрагмент этой цепи CLIP встраивается в бороздку молекулы HLA класса II. Везикулы, содержащие такие молекулы HLA (без антигенного пептида), сливаются с ранними эндосомами или первичными лизосомами, которые содержат экзогенные белки.

 

16\

Фагоцитоз-это комплекс клеточных событий, в основе которых лежит распознавание, опсонизация, поглощение и элиминация из организма корпускулярных частиц размером меньше 0,5 мкм.

Моноциты

Моноциты – одно их первых названий, которые всплывают в памяти при упоминании о фагоцитозе. Эти осуществляющие фагоцитоз лейкоциты непрерывно перемещаются в крови, «сканируя» окружающее пространство на предмет наличия в нем вредоносных объектов. Найдя «обидчика», они захватывают и уничтожают его. После этого, избавившись от продуктов расщепления бактерии, микропаразита или вируса, они продолжают свою работу в аналогичном направлении.

При фагоцитозе моноцит справляется с вредными объектами всего за 9 минут. Иногда он поглощает и расщепляет клетки и субстраты, превышающие его по размерам в несколько раз.

 

Нейтрофилы

Фагоцитоз нейтрофилов осуществляется похожим образом, с той лишь разницей, что они работают по принципу «Светя другим, сгораю сам». Это значит, что, захватив патоген и уничтожив его, нейтрофил погибает.

 

Макрофаги

Макрофаги – это осуществляющие фагоцитоз лейкоциты, образовавшиеся из моноцитов крови. Они располагаются в тканях: как непосредственно под кожей и слизистыми, так и в глубине органов. Существуют особые разновидности макрофагов, которые находятся в конкретных органах.

Например, в печени «живут» клетки Купфера, задача которых состоит в разрушении старых компонентов крови. В легких располагаютсяальвеолярные макрофаги. Эти клетки, способные к фагоцитозу, захватывают вредные частицы, проникшие в легкие с вдыхаемым воздухом, и переваривают их, разрушая своими ферментами: протеазами, лизоцимом, гидролазами, нуклеазами и т.д.

Обычные тканевые макрофаги обычно погибают после встречи с патогенами, то есть в этом случае происходит то же, что и при фагоцитозе нейтрофилов.

 

Дендритные клетки

Эти клетки – угловатые, ветвистые – совершенно не похожи на макрофаги. Тем не менее, они являются их родственниками, так как тоже образуются из моноцитов крови. К фагоцитозу способны только молодые дендритные клетки, остальные в основном «работают» слимфоидной тканью, обучая лимфоциты правильно реагировать на некоторые антигены.

 

Тучные клетки

Помимо того, что тучные клетки запускают реакцию воспаления, эти лейкоциты способны к фагоцитозу. Особенность их работы состоит в том, что они уничтожают только грамотрицательные бактерии. Причины такой «разборчивости» не совсем понятны, видимо, у тучных клеток есть к этим бактериям особое сродство.

Они могут уничтожить сальмонеллу, кишечную палочку, спирохету, многих возбудителей ЗППП, но совершенно равнодушно воспримут возбудителя сибирской язвы, стрептококка и стафилококка. Борьбой с ними займутся другие лейкоциты.

Перечисленные выше клетки – это профессиональные фагоциты, об «опасных» свойствах которых известно всем. А теперь несколько слов о тех клетках, для которых фагоцитоз – не самая типичная функция.

 

Тромбоциты

Тромбоциты, или кровяные пластинки, занимаются главным образом тем, что отвечают за свертываемость крови, прекращают кровотечения, формируют тромбы. Но, помимо этого, у них обнаружены и фагоцитарные свойства. Тромбоциты могут образовывать ложноножки и уничтожать некоторые вредные компоненты, попавшие в организм.

 

Клетки эндотелия

Оказывается, клеточная выстилка сосудов тоже представляет опасность для бактерий и прочих «захватчиков», проникших в организм. В крови с чужеродными объектами борются моноциты и нейтрофилы, в тканях их поджидают макрофаги и другие фагоциты, и даже в стенках сосудов, находясь между кровью и тканями, «враги» не могут «чувствовать себя в безопасности». Воистину, возможности защиты организма чрезвычайно велики. При увеличении содержания в крови и тканях гистамина, что происходит при воспалении, фагоцитирующая способность клеток эндотелия, почти незаметная до этого, возрастает в несколько раз!

 

Гистиоциты

Под этим собирательным названием объединяют все клетки тканей: соединительной ткани, кожи, подкожной клетчатки, паренхимы органов и так далее. Раньше этого никто не мог предположить, но оказывается, при определенных условиях многие гистиоциты способны менять свои «жизненные приоритеты» и тоже приобретать способность к фагоцитозу! Повреждения, воспаление и другие патологические процессы пробуждают в них эту способность, которая в норме отсутствует.

 

 

17\

Методика определения фагоцитарной активности лейкоцитов

Принцип метода. Некоторые клетки белой крови (гранулоциты и в меньшей степени моноциты) способны in vitro и in vivo поглощать, а часто и разрушать чужеродные частицы с помощью своих ферментов. Причем сам процесс проходит несколько стадий, которые включают хемотаксис, фагоцитоз, разрушение микробов и переваривание поглощенных веществ. При повторном контакте или специфической иммунизации клетки опсонируются, т. е. эта способность усиливается. Разработано большое число методик определения фагоцитарной активности клеток крови. Для этих целей используют определенную тест-систему (конкретный вид микробов, зимозан). В одних случаях реакцию проводят в пробирках или чашках Петри на агаре, а в других — внутри организма животного (внутрисосудисто, интраперитенально или методом «окошка рога»).
Ход определения.
1. Приготовление тест-системы: микробная взвесь с содержанием 1—2 млрд тел в 1 мл по оптическому стандарту.
2. Смешивание 2%-ного раствора лимоннокислого натрия, крови и микробной взвеси в соотношении 1:2:1 и термостатирование 30 мин при температуре 40,5 °С.
3. Центрифугирование при 1500 об/мни 10 мин и приготовление мазков на предметных стеклах из верхнего слоя осадка и на агаре в чашках Петри.
4. Фиксация препаратов метиловым спиртом в течение 3—5 мин и окраска по Романовскому — Гимза в течение 10—15 мин.
5. Учет реакции. В окрашенных мазках под микроскопом (увеличите 90x7) подсчитывают 100 нейтрофилов или моноцитов, содержащих или нет микробов, учитывая количество микробов в клетке и степень их окраски (переваривание). Высчитывают процент фагоцитированных клеток — показатель активности, и среднее число микробов па один фагоцит — фагоцитарный индекс; отношение числа переваренных микробов к общему числу фагоцитированных клеток дает процент переваривания, а среднее их число на один фагоцит дает индекс переваривания.
Для количественной оценки переваривающей способности фагоцитов введено понятие индекса завершенности фагоцитоза. Для этого определяют отношение процента фагоцитоза, полученного через 30 мин инкубации, к проценту фагоцитоза через 2 ч и отношение фагоцитарных индексов. Принято считать, что если индекс завершенности фагоцитоза больше 1, то фагоцитоз завершенный, если меньше — то незавершенный. Для оценки степени повышения фагоцитозной активности лейкоцитов при специфической иммунизации высчитывают опсонофагоцитарный индекс по отношению фагоцитарных чисел у иммунизированных и контрольных животных. У новорожденных животных целесообразно вычислить элиминирующую способность лейкоцитов крови по абсолютному числу фагоцитированных микробов всеми фагоцитами, содержащимися в 1 мкл крови, т. е. получить абсолютные показатели.

Сокращенный вариант:

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов. Определение С-реактивного белка крови Берут 0,05 мл 2% лимоннокислого натрия, 0,1 мл крови, 0,05 мл взвеси микробов убитых или живых бактериальной флоры стафилококка. Можно взять и в следующих пропорциях: 0,25 мл 2% лимоннокислого натрия, 0,5 мл крови из вены, 0,25 мл взвеси микробов. Пробирку помещают на 30 минут в термостат при температуре 37°. После извлечения из термостата встряхивают и готовят мазки, фиксируют спиртом и окрашивают по Романовскому — Гимза 20—30 минут. Подсчитывают микробы, фагоцитированные 25 нейтрофилами. Максимальный показатель составляет 75, если фагоцитоз всех 25 лейкоцитов оценен тремя плюсами, т. е. если каждым лейкоцитом поглощен 41 микроб.

 

18\

Гуморальное звено иммунитета характеризуют уровни CD3^-CD19⁺, CD3-CD20⁺, CD3-CD21⁺ и CD3^-CD22⁺-клеток (В-лимфоцитов в разные фазы созревания), а также уровни иммуноглобулинов разных классов (IgМ, IgG, IgE, сывороточного и секреторного IgA). Поскольку синтез антител является Т-зависимым процессом, для надлежащей оценки гуморального звена иммунитета следует учитывать уровень
Т-хелперов (CD3⁺СD4⁺ Т-лимфоцитов), что еще раз подтверждает целесообразность комплексного подхода к интерпретации иммунограммы. Гуморальное звено является преобладающим при бактериальных инфекциях с внеклеточным пребыванием патогена (стрептококки, стафилококки, эшерихии, синегнойная палочка, протей и др.), а также при полостных протозойных и гельминтных инвазиях.

 

19\

 

 

Основными формами иммунного ответа на попадание антигена в организм являются: биосинтез антител, образование клеток иммунной памяти, реакция гиперчувствительности немедленного типа, реакция гиперчувствительности замедленного типа, иммунологическая толерантность, идиотип- антиидиотипические отношения.

Для гуморального иммунитета характерна выработка специфических антител (иммуноглобулинов).

Антитела - специфические белки гамма- глобулиновой природы, образующиеся в организме в ответ на антигенную стимуляцию и способные специфически взаимодействовать с антигеном (in vivo, in vitro). В соответствии с международной классификацией совокупность сывороточных белков, обладающих свойствами антител, называют иммуноглобулинами.

Уникальность антител заключается в том, что они способны специфически взаимодействовать только с тем антигеном, который вызвал их образование.

Иммуноглобулины (Ig) разделены в зависимости от локализации на три группы:

- сывороточные (в крови);

- секреторные (в секретах- содержимом желудочно- кишечного тракта, слезном секрете, слюне, особенно- в грудном молоке) обеспечивают местный иммунитет (иммунитет слизистых);

- поверхностные (на поверхности иммунокомпетентных клеток, особенно В- лимфоцитов).

Любая молекула антител имеет сходное строение (Y- образную форму) и состоит из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей, связанных дисульфидными мостиками. Каждая молекула антител имеет два одинаковых антигенсвязывающих фрагмента Fab (fragment antigen binding), определяющих антительную специфичность, и один Fc (fragment constant) фрагмент, который не связывает антиген, но обладает эффекторными биологическими функциями. Он взаимодействует со “своим” рецептором в мембране различных типов клеток (макрофаг, тучная клетка, нейтрофил).

Концевые участки легких и тяжелых цепей молекулы иммуноглобулина вариабельны по составу (аминокислотным последовательностям) и обозначаются как VL и VH области. В их составе выделяют гипервариабельные участки, которые определяют структуру активного центра антител (антигенсвязывающий центр или паратоп). Именно с ним взаимодействует антигенная детерминанта (эпитоп) антигена. Антигенсвязывающий центр антител комплементарен эпитопу антигена по принципу “ключ - замок” и образован гипервариабельными областями L- и Н- цепей. Антитело свяжется антигеном (ключ попадет в замок) только в том случае, если детерминантная группа антигена полностью вместится в щель активного центра антител.

Легкие и тяжелые цепи состоят из отдельных блоков- доменов. В легких (L) цепях - два домена- один вариабельный (V) и один константный (C), в тяжелых (H) цепях- один V и 3 или 4 (в зависимости от класса иммуноглобулина) C домена.

Существуют легкие цепи двух типов- каппа и лямбда, они встречаются в различных пропорциях в составе различных (всех) классов иммуноглобулинов.

Выявлено пять классов тяжелых цепей- альфа (с двумя подклассами), гамма (с четырьмя подклассами), эксилон, мю и дельта. Соответственно обозначению тяжелой цепи обозначается и класс молекул иммуноглобулинов- А, G, E, M и D.

Именно константные области тяжелых цепей, различаясь по аминокислотному составу у различных классов иммуноглобулинов, в конечном результате и определяют специфические свойства иммуноглобулинов каждого класса.

Известно пять классов иммуноглобулинов, отличающихся по строению тяжелых цепей, молекулярной массе, физико- химическим и биологическим характеристикам: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. В составе IgG выделяют 4 подкласса (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), в составе IgA- два подкласса (IgA1, IgA2).

Структурной единицей антител является мономер, состоящий из двух легких и двух тяжелых цепей. Мономерами являются IgG, IgA (сывороточный), IgD и IgE. IgM- пентамер (полимерный Ig). У полимерных иммуноглобулинов имеется дополнительная j (joint) полипептидная цепь, которая объединяет (полимеризует) отдельные субъединицы (в составе пентамера IgM, ди- и тримера секреторного IgA).

Основные биологические характеристики антител.

1. Специфичность - способность взаимодействия с определенным (своим) антигеном (соответствие эпитопа антигена и активного центра антител).

2. Валентность- количество способных реагировать с антигеном активных центров (это связано с молекулярной организацией- моно- или полимер). Иммуноглобулины могут быть двухвалентными (IgG) или поливалентными (пентамер IgM имеет 10 активных центров). Двух- и более валентные антитела навывают полными антителами. Неполные антитела имеют только один участвующий во взаимодействии с антигеном активный центр (блокирующий эффект на иммунологические реакции, например, на агглютинационные тесты). Их выявляют в антиглобулиновой пробе Кумбса, реакции угнетения связывания комплемента.

3. Афинность - прочность связи между эпитопом антигена и активным центром антител, зависит от их пространственного соответствия.

4. Авидность - интегральная характеристика силы связи между антигеном и антителами, с учетом взаимодействия всех активных центров антител с эпитопами. Поскольку антигены часто поливалентны, связь между отдельными молекулами антигена осуществляется с помощью нескольких антител.

5. Гетерогенность - обусловлена антигенными свойствами антител, наличием у них трех видов антигенных детерминант:

- изотипические - принадлежность антител к определенному классу иммуноглобулинов;

- аллотипические- обусловлены аллельными различиями иммуноглобулинов, кодируемых соответствующими аллелями Ig гена;

- идиотипические- отражают индивидуальные особенности иммуноглобулина, определяемые характеристиками активных центров молекул антител. Даже тогда, когда антитела к конкретному антигену относятся к одному классу, субклассу и даже аллотипу, они характеризуются специфическими отличиями друг от друга (идиотипом). Это зависит от особенностей строения V- участков H- и L- цепей, множества различных вариантов их аминокислотных последовательностей.

Понятие о поликлональных и моноклональных антителах будет дано в следующих разделах.