Иммунологические методы с применением химических меток

Иммунологические реакции, такие, как иммунофлюоресценция, иммуноферментный анализ, радиоиммунологический анализ, иммунный блоттинг характеризуется применением различных способов детекции (обнаружения) комплекса антиген — антитело на основе химических или физических меток (флюоресцирующих веществ, ферментсубстратных взаимодействий, приводящих к окрашиванию реакционной смеси, радиоактивных изотопов), что имеет целью достижения большей чувствительности и специфичности анализа по сравнению с серологическими методами, основанными на естественных феноменах.

· Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Иммунофлюоресцентный метод (непрямой вариант) представлен двухэтапной реакцией, при которой обнаружение искомого антитела в комплексе антиген - антитело (АГ - АТ) (1 этап) происходит с помощью конъюгата - антиглобулина, гомологичного по отношению к белкам иммунной сыворотки, меченного флюоресцеин-изотиоцианатом. Добавление конъюгата не обязательно для выявления комплекса АГ - АТ при наблюдении в люминесцентном микроскопе. В диагностический набор для РИФ входит: антигенный препарат (специально размеченные предметные стекла с зафиксированной на их поверхности взвеси корпускулярного антигена), контрольные положительная и отрицательная сыворотки, люминесцирующая антивидовая сыворотка и реагенты.

Принцип проведения реакции иммунофлюоресценции (непрямой вариант).

- Подготовка растворов.

- Титрование испытуемых сывороток и их контрольных образцов.

- Нанесение подготовленных разведений испытуемых и контрольных образцов сывороток на специально размеченные предметные стекла с антигеном.

- Инкубация препаратов с образцами во влажной камере (время и температура согласно инструкции).

- Отмывание препаратов в трех сменах фосфатно-солевого буфера (ФСБ) от непрореагировавших компонентов сыворотки.

- Высушивание препаратов на воздухе.

- Нанесение люминесцирующей антисыворотки (конъюгата) в рабочем разведении на стекла с антигеном.

- Инкубация препаратов во влажной камере при комнатной температуре.

- Отмывание препаратов в трех сменах ФСБ от непрореагировавших компонентов флюоресцирующей антисыворотки.

- Высушивание на воздухе.

- Нанесение препаратов на предметное стекло в забуференный глицерин под покровные стекла.

- Микроскопирование препаратов в люминесцентном микроскопе.

Результаты реакции оценивают по наличию и интенсивности поверхностного зеленовато-желтого свечения клеток антигена по 4-балльной системе:

- 3 - 4 креста - яркая флюоресценция зеленого цвета по периферии клетки токсоплазм, четко контрастирующая с телом клетки;

- 2 креста - слабое, но явно зеленое свечение периферии клетки;

- 1 крест - очень слабое свечение периферии клетки, не контрастирующее с телом клетки.

Отсутствие свечения клеток и их границ "ободка" в отрицательном контроле при ярком флюоресцировании "ободка" клеток, обработанных положительной контрольной сывороткой, подтверждает надежность проводимого исследования.

За титр реакции принимают то разведение сыворотки, в котором 50% и более клеток антигена в каждом изученном поле зрения имеют четкое специфическое поверхностное свечение. Значение диагностического титра - 1/80 - 1/100.

· Иммуноферментный анализ (ИФА)

Реакция иммуноферментного анализа (ИФА) основана на специфическом взаимодействии антигена и антитела с предварительной иммобилизацией (фиксацией) одного из компонентов реакции (антигена или антител) на твердофазном носителе (в лунках полистироловых планшетов, стрипов и др.) и выявлении образовавшегося комплекса АГ - АТ посредством ферментной метки (конъюгат). Выявление образовавшегося комплекса осуществляется по изменению интенсивности окраски (оптической плотности) субстратной смеси, содержащей вещество, с которым реагирует фермент, и индикатор, изменяющий цвет под действием продуктов реакции фермент - субстрат.

Реакция ИФА обладает рядом преимуществ перед другими серологическими тестами, которые состоят в следующем:

- высокой специфичности и чувствительности;

- возможности использования универсальных реагентов и отконтролированных диагностических тест-систем; высокая стабильность реагентов (не менее 6 месяцев);

- возможность стандартизации проведения анализа и учета его результатов за счет автоматизации процесса.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводят в два этапа: первый — взаимодействие антител с антигеном, второй — ферментативная индикация комплекса антиген — антитело за счет появления окрашивания реакционной смеси и регистрации окрашивания визуально либо спектрофотометрическим методом.

Существуют два варианта ИФА: твердофазный и жидко-фазный, различающиеся по способу разделения компонентов иммунохимической реакции. По сравнению с описанными ранее методами выявления антигенов и антител ИФА обладает существенными преимуществами:

— высокой чувствительностью, позволяющей определять до 0,05 нг/мл вещества;

— возможностью использования минимальных объемов исследуемого материала (1—2 мкл);

— возможностью инструментального или визуального учета реакции;

— экспрессностью и возможностью автоматизации всех этапов реакции.

ИФА в настоящее время широко используют в практике для диагностики многих инфекционных болезней бактериальной, грибковой этиологии, протозойных инфекций и гельминтозов, но особенно вирусных инфекций, в частности гепатитов А, В, С, D, Е, G, ВИЧ-инфекции, герпесвирусных, ротавирусных, аденовирусных, астровирусных, парвовирусных и других инфекций.

 

· Иммуноблоттинг и радиоиммунопреципитация

Иммуноблоттинг (Western-blot) представляет собой один из наиболее чувствительных и специфичных методов анализа антигенной специфичности антител сыворотки больного. В основе этого метода лежит электрофорез антигенов в полиакриламидном геле с последующим перенесением (блоттингом) на нитроцеллюлозную мембрану белкового материала, фракционированного в соответствии с зарядом и массой антигенов. После этого мембрана блокируется индифферентным белком для предотвращения неспецифического связывания антител. Далее мембрана с нанесенными на нее белками инкубируется с сывороткой, содержащей антитела. После связывания антител с соответствующими мишенями, комплексы антиген-антитело выявляются с помощью античеловеческой сыворотки, меченной ферментом. На последнем этапе фермент-содержащие комплексы визуализируют с помощью ферментного субстрата, окисление которого приводит к образованию нерастворимых, окрашенных продуктов ферментативной реакции в месте расположения комплексов.

Этот метод позволяет обнаружить сывороточные антитела и описать соответствующие им антигены в зависимости от их молекулярной массы. Этот метод не требует высокоочищенных антигенов, референтных и контрольных сывороток. Идентификация мишени аутоантител основана на молекулярном весе белка, с которым реагируют аутоантитела из сыворотки пациента. В одной реакции может быть обнаружено связывание антител с несколькими антигенами, каждый из которых может быть точно охарактеризован. За счет этого иммуноблоттинг обладает рядом преимуществ перед другими методами выявления аутоантител, результаты которых зависят от стандартизации, чувствительности, качества субстрата, нестабильности или нерастворимости определенных антигенов. Тем не менее, при электрофорезе возможно разрушение определенных конформационных эпитопов, что несколько снижает чувствительность метода. Кроме того, иммуноблоттинг позволяет провести только качественный анализ.

По чувствительности иммуноблоттинг сравним с иммуноферментным методом, однако в классическом варианте требует значительного опыта и весьма трудоемок. За последние несколько лет широкое распространение получили методы, основанные на дот (слот)-блоттинге. В этом случае на нитроцеллюлозную мембрану через тонкие прорези наносятся чистые рекомбинантные антигены. Таким образом, на одном листке может быть получен отпечаток 10-20 различных белков. Количество расходуемых антигенов в несколько раз меньше, чем при типичном ИФА-методе, что снижает стоимость обследования. Хотя слот-блоттинг дает в лучшем случае полуколичественный ответ, не лишен проблем со стабильностью и сохранностью антигенов, однако его высокая чувствительность и сравнительная дешевизна делают его одним из базовых тестов для выявления основных специфичностей антител.

Радиоиммунные тесты в практической диагностике аутоиммунных заболеваний используются ограниченно. Всего три задачи решаются с помощью радиоиммунных тестов. Они включают выявление антител к дсДНК (см. ниже), антитела к ацетилхолиновому рецептору и рецептору тиреотропного гормона. В то же время радиоиммунопреципитация остается одним из совершенных аналитических методов поиска новых антигенов аутоантител, основанных на иммуноблоттинге. С помощью радиоиммунопреципитации были точно охарактеризованы большинство минорных антигенов антинуклеарных антител. В качестве антигенов в этом методе используются ядерные экстракты человеческих клеточных линий, таких как К562 или НеLа, культивируемых в присутствии аминокислот, меченных изотопами. После связывания антигенов и антител в растворе иммунные комплексы преципитируют, после чего подвергают аналитическому электрофорезу в полиакриламидном геле.

Ауторадиография позволяет идентифицировать белки и тем самым установить точную специфичность антител. Использование меченных изотопами белков и нуклеиновых кислот делает этот метод чрезвычайно чувствительным и позволяет применять его в качестве стандарта по отношению к другим методам. Так как нет необходимости в предварительной очистке субстрата, антигены представлены в нативном виде. Связывание антигена и антитела происходит в растворе, что теоретически соответствует условиям реакций in vivo.

30. Система комплемента — комплекс белков, постоянно присутствующих в крови. Это каскадная система протеолитических ферментов, предназначенная для гуморальной защиты организма от действия чужеродных агентов, она участвует в реализации иммунного ответа организма. Является важным компонентом как врождённого, так и приобретённого иммунитета.

· История понятия

В конце XIX столетия было установлено, что сыворотка крови содержит некий «фактор», обладающий бактерицидными свойствами. В 1896 году молодой бельгийский ученый Жюль Борде, работавший в Институте Пастера в Париже, показал, что в сыворотке имеются два разных вещества, совместное действие которых приводит к лизису бактерий: термостабильный фактор и термолабильный (теряющий свои свойства при нагревании сыворотки) фактор. Термостабильный фактор, как оказалось, мог действовать только против определенных микроорганизмов, в то время как термолабильный фактор имел неспецифическую антибактериальную активность. Термолабильный фактор позднее был назван комплементом. Термин «комплемент» ввел Пауль Эрлих в конце 1890-х годов. Эрлих был автором гуморальной теории иммунитета и ввел в иммунологию много терминов, которые впоследствии стали общепринятыми. Согласно его теории клетки, ответственные за иммунные реакции, имеют на поверхности рецепторы, которые служат для распознавания антигенов. Эти рецепторы мы сейчас называем «антителами» (основой вариабельного рецептора лимфоцитов является прикреплённое кмембране антитело класса IgD, реже IgM. Антитела других классов в отсутствие соответствующего антигена не прикреплены к клеткам). Рецепторы связываются с определенным антигеном, а также с термолабильным антибактериальным компонентом сыворотки крови. Эрлих назвал термолабильный фактор «комплементом» потому, что этот компонент крови «служит дополнением» к клеткам иммунной системы.

Эрлих полагал, что имеется множество комплементов, каждый из которых связывается со своим рецептором, подобно тому, как рецептор связывается со специфическим антигеном. В противоположность этому Борде утверждал, что существует «дополнение» только одного типа. В начале XX века спор был разрешен в пользу Борде; выяснилось, что комплемент может активироваться с участием специфических антител или самостоятельно, неспецифическим способом.

Общее представление