Определение концентрации триглицеридов

В сыворотке крови

Цель занятия: Закрепление теоретических знаний и приобретение навыков самостоятельной работы.

Знать: 1. Патология жирового обмена.

2. Роль триглицеридов.

3. Понятие о гиперлипопротеидемии.

4. Регуляция липидного обмена.

Уметь: 1. Работать с КФК.

2. Выполнить методику определения содержания триглицеридов в сыворотке крови ферментативным методом.

Принцип метода. Триглицериды в пробе определяются с помощью каскада реакций, описанных ниже, которые приводят к образованию окрашенного комплекса, количество которого может быть измерено спектрофотометрически.

триглицериды + Н₂О ® глицерол + жирные кислоты

глицерол + АТФ ® глицерол-3-ф + АДФ

глицерол-3-ф + О₂ ® дигидрооксиацетон-ф + Н₂О₂

2Н₂О₂ + 4-аминоантипирин + 4-хлорфенол ®хинонеимин + 4Н₂О

Реактивы: основной реагент, стандарт триглицеридов С тг = 2,44 ммоль/л.

Приготовление реагента: реагент и стандарт поставляются в готовом к употреблению виде.

Ход работы 1. Доведите реагент до комнатной температуры.

2. Внесите пипеткой в маркированные пробирки (примечание 1).

 

	Контроль	Стандарт (Ст)	Образец (О)
Стандарт	___	0,05 мл	___
Образец	___	____	0,05 мл
Реагент	5 мл	5 мл	5 мл

 

3. Тщательно смешайте, инкубируйте пробирки 15 мин при комнатной температуре (16-25^оС).

4. Учитывайте абсорбцию (Е) стандарта и образца при 490 нм по отношению к контролю. Цвет стабилен минимум в течение 2 часов.

Концентрация триглицеридов в образце вычисляется по следующей формуле:

С_{триглицеридов} = х Сст, где

С_тр – концентрация триглицеридов в сыворотке крови;

Еon – экстинкция опытной пробы;

Ест – экстинкция стандартной пробы;

Сст – концентрация стандартного раствора в моль/л.

Клинико-диагностическое значение. Гипертриглицеридемия бывает физиологическая, алиментарная, эмоциональная. Определение уровня триглицеридов имеет наибольшее значение для типирования гиперлипидемии. Симптоматические гипертриглицеридемии отмечаются при вирусом гепатите, панкреатитах, нефротическом синдроме, гипертонии, атеросклерозе, остром инфаркте миокарда, при гипотиреозе, сахарном диабете, подагре, при алкоголизме.

Нормы (в ммоль/л):

Возраст	мужчины	женщины
16 -19 лет	0,45 -1,84	0,45 – 1,45
20 -29 лет	0,5 – 1,9	0,45 – 1,45
30 -39 лет	0,55 – 2,1	0,43 – 1,81

 

Кетоновые тела. Реакция образования йодоформа

В щелочной среде йод взаимодействует с ацетоном, образуя йодоформ, который обнаруживают по характерному запаху и иногда – по появлению мути, возникающей вследствие плохой растворимости йодоформа в воде:

СН₃ – С – СН₃ + 3I₂ + 4NaOH ® 3H₂O + 3NaI + CHI₃ + CH₃COONa

║

O

Для выполнения реакции в пробирку к 3 мл мочи добавляют по 5 капель реактива Люголя и 10% гидроксида натрия. Содержимое пробирки перемешивают и отмечают результат.

2. В щелочной среде кетоновые тела дают с нитропрусидом натрия оранжево-красную окраску. Уравнение химической реакции следующее:

СН₃ –С–СН₃ + Na₂[Fe(CN)₅NO] + 2NaOH ® H₂O + Na₄[Fe(CN)₅NO=CHCOCH₃]

║

O

При добавлении к реакционной смеси концентрированной уксусной кислоты образуется соединение, окрашенное в темно-красный цвет. Уравнение реакции:

Na₄[Fe(CN)₅NO=CHCOCH₃]+СН₃СООН®

→ Na₃[Fe(CN)₅NOCH₂COCH₃]+СН₃СООNa

Клинико-диагностическое значение. При внутриклеточном дефиците глюкозы происходит избыточное образование кетоновых тел. Это наблюдается при сахарном диабете, а также при малоуглеводной диете, богатой жирами, при длительном голодании (более 2-5 суток).

Если в норме за сутки с мочой выводится около 40 мг кетоновых тел, то при сахарном диабете содержание ацетоновых тел в суточной порции мочи может доходить до 10-50 г и более.

 

Контрольные вопросы по теме

1. Какая химическая связь характерна для нейтральных жиров?

2. Какую роль в организме выполняют липиды?

3. Какова биологическая роль ненасыщенных жирных кислот?

4. Где происходит процесс переваривания липидов и какие ферменты в этом участвуют?

5. Какую роль в процессах переваривания и всасывания выполняют желчные кислоты?

6. Что понимают под названием «транспортные формы липидов»?

7. Чем отличается процесс переваривания липидов от переваривания углеводов?

8. Как используются продукты переваривания липидов после всасывания?

9. На каком клеточном уровне происходит процесс окисления высших жирных кислот?

10. Какую роль в процессе окисления жирных кислот выполняет карнитин? Напишите их взаимодействие.

11. Напишите реакцию активации жирных кислот.

12. Чем отличается процесс окисления ненасыщенных жирных кислот от насыщенных?

13. Напишите химизм реакции образования свободной ацетоуксусной кислоты и какова ее дальнейшая утилизация?

14. Что входит в понятие ацетоновые тела, напишите химизм образования их.

15. При каких метаболических нарушениях наблюдается ацетонурия?

16. Напишите химизм образования малонил-КоА. Для чего он используется?

Напишите процесс синтеза масляной кислоты.

17. Напишите процесс удлинения углеродной цепи бутирил-АПБ.

18. Посчитайте сколько молекул малонил-КоА необходимо для синтеза стеариновой кислоты.

19. Сколько молекул восстановленных коферментов НАДФ Н+Н⁺ необходимо для синтеза стеариновой кислоты?

Обмен жироподобных веществ

(Холестерин и фосфатиды)

I. Цель изучения: знать классификацию, строение, функции холестерола и фосфатидов, понятия о их синтезе, участие в обмене веществ, транспортных формах, молекулярных причинных патологий метаболизма этих веществ.

II. Уметь определить содержание ЛНП всыворотке крови, как основного донора холестерина в клетки; познакомиться с выявлением фосфолипаз в дуоденальном содержимом, проделать качественную реакцию на наличие желчных кислот в желчи.

III. Заполнить контурные карты: 1) классификация фосфатидов; 2) химия фосфатидов; 3) распад лецитина; 4) биосинтез лецитина; 5) стерины и стериды; 6) биосинтез холестерина; 7) желчные кислоты.

IV. Ответить на контрольные вопросы к занятию.

V. Содержание темы:

1. Фосфолипиды, имея в своем составе полярные и неполярные компоненты, являются идеальными структурными единицами мембран.

Азотистые основания, входящие в состав фосфатидов (схема)

Фосфатиды всегда содержат жирные кислоты и фосфорную кислоту, но отличаются по азотистому основанию и спирту:

 

название фосфатидов	азотистые основания	спирт
лецитины (холинфосфатиды)	холин	глицерин
кефалины (этаноламинфосфатиды)	этаноламин=коламин	глицерин
серинфосфатиды	серин	глицерин
ацетальфосфатиды	этаноламин или холин (или серин)	глицерин
сфингомиелины	холин	сфингозин
инозитфосфатиды	этаноламин	глицерин, инозит

 

Химия фосфатидов

2. При переваривании фосфолипидов, кроме жирных кислот и глицерина образуются специфические аминоспирты и фосфорная кислота в результате действия фосфолипаз.

3. Эфиры холестерина тоже гидролизуются холестеролэстеразами до холестерина и жирных кислот.

Химия стеринов и стеридов

Стериды – это сложные эфиры циклических спиртов стеринов и высших жирных кислот.

Стерины -циклические спирты, производные циклопентанопергидрофенантрена.

К группе стеринов относятся:

1. холестерин;

2. провитаминв D;

3. гормона кора надпочечников;

4. половые гормоны;

5. желчные кислоты.

Стерин:

 

Стерид:

 

4. Из продуктов гидролиза образуются смешанные мицеллы, где с помощью солей желчных кислот образуется полярная оболочка, а гидрофобные хвосты погружаются во внутрь мицеллы и в таком виде всасываются вместе жирорастворимыми витаминами (А, D, E и К) в клетки слизистой оболочки тонкого кишечника.

5. В клетках слизистой оболочки кишечника кроме ресинтеза жиров моноглицеридным путем (см. прошлое занятие), под действием ацилхолестерол-ацилтрансферазы (АХАТ) синтезируются и эфиры холестерина, которые с жирами, витаминами и фосфолипидами образуют хиломикроны и липопротеины очень низкой плотности (ЛОНП), они покрываются белковой оболочкой (В-48), синтезированной на шероховатом эндоплазматической ретикулуме и в таком виде поступают в кровь.

6. При дефекте апобелков (В-48 – в кишечнике, В-100 – в печени) переферических апобелков С-II (активирующих липопротеинлипазу, расщепляющую триглицериды липопротеинов), Е – (контактирующий с рецепторами липопротеинов) ведет к гипертриглицеролемии (содержание триглицеридов в крови повышена, при норме =165 мг/дл) и накоплению капелек жира в клетках кишечника или жировому перерождению печени.

7. Липопротеины, потерявшие основную часть жира, обогащенные холестерином, отдают свои периферические белки снова на липопротеины высокой плотности (ЛВП), откуда они их получили при своем созревании и превращаются в липопротеины низкой плотности (ЛНП), в которых содержание холестерина»50%, а остальное - триглицериды (ТГ), фосфолипиды (ФЛ) и белковая оболочка – В-100.

8. Апопротеин В-100 взаимодействует с рецепторами ЛПНП и холестерин попадает в клетки, где может быть использован при образовании мембран (особенно миелиновых оболочек нервов) для синтеза желчных кислот 0,5-0,7 г в сутки (в гепатоцитах), стероидных гормонов (»40 мг), витамина D₃ (~10 мг).

9. Рецепторы ЛНП, сложные белки, синтезируются в ЭР и аппарате Гольджи, эксионируются на поверхности клетки в ямках, окаймленных белком клатрином. В образовавшую эндосому Н⁺ - АТФ-азой заканчиваются протоны, понижается рН и рецепторы отделяются от ЛНП, ЛНП попадают в лизосомы, где гидролизуется все, кроме холестерина.

10. В печень поступает холестерин пищевой (экзогенный), но кроме этого при его недостаточности, синтезируется эндогенный ~ 1г в сутки.

Биосинтез холестерина

Регуляторным ферментом является ГМГ – редуктаза, которая активируется инсулином (дефосфорилированием) и ингибируется глюкагоном и адреналином, которые ведут к фосфорилированию редуктазы. Кроме того избыточное количество экзогенного холестерина ингибирует синтез эндогенного холестерина.

11. В печени холестерин под действием гидроксилаз вводятся дополнительно атомы кислорода в циклопентанпергидрофенантреновое ядро в положении 7, (хенодозоксихолевая кислота) и 12 (холевая кислота).

Желчные кислоты участвуют в переваривании липидов, способствуя:

1. Эмульгированию жира;

2. Активированию липазы поджелудочного сока;

3. Всасыванию жирных кислот.

Желчные кислоты – это производные холановой кислоты.

Конъюганты этих первичных желчных кислот с глицином и таурином дают соответствующие соли – отличные детергенты, помогающие с выделяющейся желчью эмульгированию жиров в дуоденуме.

12. Около 95% желчных кислот, попавших в кишечник, возвращается в печень через воротную вену, которые снова, по мере поступления жиров в 12-перстную кишку секретируются вместе с желчью: за сутки 2-4 г их повторно используются 6-8 раз. Этот путь называют энтерогепатической циркуляцией. Часть желчных (первичных) кислот в кишечнике под действием бактерий превращается во вторичные – дезоксихолевую и митохолевую. С фекалиями ежедневно выносятся желчные кислоты (0,5 - 0,7г) и холестерин из желчи (0,5 - 0,7г).

13. Регуляторный фермент синтеза желчных кислот (7-α-гидроксилаза) регулируется холестерином, который индуцирует транскрипцию фермента; также действуют и тироидные гормоны, а эстрогены репрессируют синтез желчных кислот.

14. Холестерин, желчные кислоты, фосфатиды, желчные пигменты должны находиться в определенной пропорции, при нарушении которой холестерин начинает осаждаться, пропитывается билирубином, солями Са и образует камни. У большинства больных желчно-каменной болезнью активность ГМГ – редуктазы повышена, а 7-гидроксилазы понижена, что приводит к увеличению холестерина и уменьшению количества желчных кислот. Хенодезоксихолевая кислота может растворять камни, но процесс долог.

15. Концентрация холестерола в крови не должна превышать 5,2 ммоль/л, однако, кроме гиперхолестиролемии большое значение в патологии обмена холестерина имеет соотношение ЛНП/ЛВП, т.к. ЛВП в противоположность ЛНП, являющихся донорами холестерина, собирают холестерин от других липопротеинов и периферических тканей, являются акцепторами холестерина и переносчиками его в печень. Эту роль выполняет фермент лецитинхолестеролацилтрансфераза, (ЛХАТ) и апобелок А-I, активирующий фермент. Эти белки находятся на поверхности ЛВП и эстерефицируют – ОН холестерина, переведя его в эфиры, которые гидрофобны и погружаются вовнутрь ядра ЛВП, освобождая поверхность для новых молекул холестерина. Таким образом, ЛВП оказывают антиатерогенное действие на организм, а атерогенные факторы – ЛНП и ЛОНП.

16. ЛНП захватываются макрофагами, которые расщепляют липиды, кроме холестерола, а при большом их содержании, холестерол может откладываться в коже, сухожилиях и в стенках артерии, образуя атеросклеротические бляшки.

17. Атеросклероз – полигенная болезнь, результат многих пичин: гиперхолестеролемией, мутации в гене в ЛНП – рецепторе, белке В-100, и других липопротеинов, увеличение коэффициента атерогенности (ЛНП/ЛВП)>3, модификаций ЛПНП под действием токсичных форм кислорода. Наиболее частые осложнения атеросклероза – ИБС, которая может привести к инфаркту.

18. Лечение гиперхолестеролемии направлены на снижение содержания холестерина в крови: диетотерапия, лечебная физкультура, лекарственная терапия.

19. Статины ингибируют синтез холестерина; витамин Е тормозит ПОЛ; ω-3 жирные кислоты синтезируют простациклин, тормозящий агрегацию тромбоцитов; никотиновая кислота повышает уровень ЛВП; фибраты активируют липопротеинлипазу; тироксин стимулирует синтез желчных кислот из холестерина; небольшие дозы этанола увеличивают синтез ЛВП.

20. Обратите внимание на синтез лецитина, как представителя фосфатидов – компонентов мембран. ЦТФ – активатор аминоспиртов, наподобие УТФ – активатора глюкозы в биосинтезе гликогена.

Биосинтез лецитина

· Активация холина с образованием фосфохолина

· Дальнейшая активация с образованием ЦДФХолина

 

 

· Взаимодействие «активного» холина (ЦДФХ) и диглицерида с образованием лецитина

 

21. Так как фосфолипиды участвуют в образовании липопротеинов, нарушение их синтеза ведет к жировому гепатозу, респираторному дистресс – синдрому, накоплению гликолипидов при понижении активности ферментов расщепления гликолипидов.

Лабораторная работа

Определение содержания β-липопротеинов сыворотки крови турбидиметрическим методом

Принцип метода. В присутствие СаСl₂ и гепарина нарушается коллоидная устойчивость белков сыворотки крови. В связи с этим осаждают почти чистые β-липопротеиды. Интенсивность помутнения раствора, определяемая фотометрически, пропорциональна содержанию β-липопротеидов.

Ход работы. В сухую пробирку наливают 0,2 мл сыворотки, добавляют 2 мл 0,025М раствора СаСl₂. Содержимое пробирки перемешивают встряхиванием и измеряют светопоглощение (Е₁) против воды при 60 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,05 см. Затем вновь переливают пробу в пробирку, добавляют 0,05 мл 1% гепарина перемешивают встряхиванием и точно через 5 минут измеряют светопоглощение (Е₂).

Расчет. Содержание β-липопротеинов: (Е₂-Е₁)·100у.е.

Норма: у здоровых людей содержание β-липопротеинов натощак равно 35-55 у.е.

Клинико-диагностическое значение. Увеличение содержания β-липопротеинов наиболее часто встречающееся в липограмме отклонение от нормы. Он наблюдается при атеросклерозе, механической желтухе, некоторых видах острого гепатита, диабете и других заболеваниях. Повышение уровня липопротеинов в крови тесно связано с гиперхолестеринемией, поскольку холестерин входит в состав главным образом β-липопротеинов. Определение уровня β-липопротеинов имеет значение не только при гиперликемических состояниях, но и как функциональная печеночная работа.

 

 

Качественная реакция на желчные кислоты (реакция Петтенкффера)

Принцип работы. При взаимодействии кислот с оксиметилфурфуролом появляется красно-фиолетовое окрашивание. Реакция обусловлена образованием окрашенных продуктов конденсации желчных кислот с оксиметилфурфуролом. Фурфурол образуется из фруктозы (сахарозы) при взаимодействии концентрированной кислоты.

Ход работы. На сухую чашку Петри или часовое стекло наносят 2 капли желчи, 2 капли 20% раствора сахарозы и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. После этого добавляют 7 капель концентрированной серной кислоты и снова перемешивают стеклянной палочкой. Через несколько минут наблюдается развитие красной окраски, которая при стоянии переходит в красно-фиолетовую.