Биолюминесценция светящихся бактерий

К числу светящихся относится немного видов бактерий. Хемилюминесцентная реакция, непосредственно сопровождаемая свечением, катализируется ферментом — бактериальной люциферазой и включает в себя процессы окисления восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-H₂ до ФМН и одновременно – алифатического (C₁₄) альдегида до миристиновой (C₁₄) кислоты. Эта реакция протекает, по-видимому, через стадию образования пероксида флавинмононуклеотида.

Здесь E – люцифераза, -OOH – гидроперекисная группа, RCOOH - алифатический альдегид, RCOOH – жирная кислота, образующаяся при окислении альдегида. В последние годы получают все большее распространение биохимические анализы, в которых в качестве тест-объекта используют целые бактериальные клетки (в суспензии), экстракты светящихся бактерий, изолированный фермент – люциферазу. Прежде всего, измерение биолюминесценции бактерий можно использовать для определения низких концентраций кислорода. Дело в том, что в отсутствие кислорода фотобактерии не обладают свечением, свечение усиливается пропорционально концентрации кислорода в среде в интервале концентраций O₂ от 2·10^-8 до 5·10^-6 моль/л. Можно использовать светящиеся бактерии и в качестве "лабораторного животного", т.е. живых организмов, на которых изучают, к примеру, действие различных токсических веществ. Светящиеся бактерии весьма чувствительны к примесям токсических веществ в воде, и измерение биолюминесценции можно использовать для оценки загрязнения воды токсическими соединениями, скажем ионами тяжелых металлов. С другой стороны, свечение бактерий можно использовать для предварительной оценки эффективности новых антибиотиков. Но наиболее перспективно, несомненно, применение очищенных препаратов бактериальной люциферазы. Фермент, очищенный от примесей низкомолекулярных соединений, обладает способностью к излучению света лишь в присутствии всех трех субстратов: кислорода, ФМН-H₂ и длинноцепочечного альдегида (с длиной цепи не менее 8 углеродных атомов). Добавив к изолированной бактериальной люциферазе ФМН-H₂, исследователь получает высокочувствительную систему для определения алифатических альдегидов; к их числу принадлежат, в частности, половые гормоны насекомых, феромоны, которые обнаруживаются в количестве 10^-14 моль, что позволяет изучать метаболизм этих веществ у одной особи. В медицине обещает найти широкое применение анализ содержания ФМН и ФАД, основанный на биолюминесцентном определении ФМН-H₂, образующегося при их предварительном восстановлению. Наиболее широкое применение в биохимических и клинических лабораторных анализах обещает получить препарат, состоящий из смеси двух компонентов (ферментов): бактериальной люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы. В отечественном наборе КРАБ (комплект реактивов для анализа биолюминесценции) содержатся люцифераза и оксидоредуктаза, выделенные из биомассы светящихся бактерий. Добавив к препарату в присутствии C₁₅-альдегида НАДН, получается высокочувствительный реактив для определения ФМН (без его предварительного восстановления):

Наоборот, если добавить к смеси люциферазы и оксидоредуктазы альдегид и ФМН, то такая смесь может использоваться как биолюминесцентная тест-система для количественного определения НАДН в биологических материалах (схема реакций такая же). Удлиняя цепочку биохимических стадий, предшествующих биолюминесценции, можно получить все новые аналитические возможности. Для определения активности ферментов дегидрогеназ или (альтернативно) для определения концентрации субстратов этих ферментов используется следующая тест-система:

Люцифераза + Оксидоредуктаза + Альдегид + ФМН + НАД^+

В присутствии субстрата какой-либо дегидрогеназы, например, в присутствии лактата, можно определять по биолюминесценции активность соответствующей дегидрогеназы (в нашем примере активность ЛДГ, лактатдегидрогеназы):

и далее по схеме, приведенной выше. В присутствии изолированной дегидрогеназы можно определять концентрацию субстрата этого фермента в интересующей нас химической или биохимической системе (схема реакций та же).

Заключение

Подобно многим другим разделам науки, хемилюминесценция и биолюминесценция вначале были объектом исследования, а потом стали методом исследования других объектов. На сегодняшний день химические и физические явления, лежащие в основе чудесного превращения энергии биохимических реакций в световое излучение, в основном расшифрованы. Началось более или менее широкое использование хеми- и биолюминесценции в биохимических лабораторных и клинических исследованиях. Создаются серийные приборы – хемилюминометры и биолюминометры, выпускаются наборы реактивов для анализа определенных антигенов, антител и ферментов в крови больных и в других биологических жидкостях. Ведется поиск новых соединений, обладающих способностью вступать в химические реакции, сопровождающиеся свечением, с химически-активными продуктами жизнедеятельности живых клеток, такими как свободные радикалы и пероксиды (химические активаторы ХЛ), равно как и веществ, усиливающих квантовый выход хемилюминесценции (физические активаторы ХЛ). Одновременно с этим расширяется применение в аналитических целей методов биолюминесценции. Прогресс органической химии, молекулярной биологии и биотехнологии избавил нас от необходимости путешествовать на юг, чтобы ловить по ночам светляков, или охотиться в океане за медузами, чтобы выделить из живых существ фермент люциферазу и субстрат биолюминесцентных реакций – люциферин: люциферины научились синтезировать, а многие люциферазы можно получить сейчас методами генной инженерии. Короче говоря, применение методов хеми- и биолюминесценции, безусловно, поможет пролить свет на многие загадки, еще не решенные учеными.

Вопросы для самоконтроля

1. Применение хемилюминесценции, сопровождающей цепное окисление липидов, в медико-биологических исследованиях.

Рекомендуемая литература

1. Владимиров Ю.А. Сверхслабые свечения при биохимических реакциях. М., Наука, 1966.

2. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция клеток животных. Итоги Науки и Техники, Сер. Биофизика, том. 24, Москва, ВИНИТИ, 1989.

3. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М. Высшая школа, 1989.

4. Ромм, А.Р., Шерстнев, М.П., Волков, В.В. and Владимиров, Ю.А. Действие лазерного излучения на перекисную хемилюминесценцию раневого экссудата. Бюл. Эксперим. Биол. и Мед. Т. 102(10), стр. 426-428, 1986 г..

5. Vladimirov Yu.A., Sherstnev M.P. Biophysical chemiluminescent analysis. In "Physicochemical Aspects of Medicine Rewiews" (Ed. Lopukhin Yu.M.), Soviet Medical Reviews/Section B, Vol. 2, Part 5. Harwood Academic Publishers GMBH, 1991, pp. 1-44.