Хемилюминесцентный иммунный анализ

По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от радиоиммунного, с той только разницей, что вместо радиоактивно-меченнных субстратов или антител используются субстраты и антитела, "меченнные" соединением, которое вступает в реакции, сопровождающиеся хемилюминесценцией, в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно это фермент пероксидаза). Хемилюминесцентной меткой (ХЛ-меткой) чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры акридиния и другие. Присоединение хемилюминесцентной метки производится либо к антигену, т.е. низкомолекулярному соединению либо к антителу на этот антиген. В первом случае метод называется CIA (Chemiluminescent Immuno Assay), во втором - ICMA (ImmunoChemiluminoMetric Assay). По-русски это соответствовало бы ХИА (Хемилюминесцентный Иммунный Анализ) и ИХМА (Иммуно-ХемилюминоМетрический Анализ). Оба метода направлены на определение биологически-важных низкомолекулярных соединений (например, гормонов) в тех концентрациях (как правило, очень низких), в которых они встречаются в биологических объектах. При использовании метода CIA (см. рис. 5, А) к раствору, содержащему интересующее нас анализируемое соединение (обозначим его как A) добавляют определенное количество того же, но ХЛ-меченнного соединения (обозначим его как A*) и антитела (анти-А). Образуется смесь меченнных и немеченнных иммунных комплексов (A-анти-A и A*-анти-А, соответственно):

A + A* + анти-A -> A-анти-A + A*-анти-A

Очень важно, что пропорция между меченнным и немеченным иммунными комплексами зависит от того, сколько меченного антигена мы добавили (A*) и сколько немеченного было в исследуемой пробе (A), а именно: чем больше было немеченного антигена, тем меньше доля меченных антител. Теперь остается очистить смесь иммунных комплексов и определить количество A*-анти-А по хемилюминесценции. Интенсивность ХЛ будет тем меньше, чем больше было немеченных антигена A (т.е. анализируемого вещества) в исследуемой пробе. Чтобы анализ был количественным, предварительно строят калибровочную кривую, т.е. измеряют зависимость интенсивности ХЛ в конечной пробе от концентрации стандартного раствора изучаемого вещества A. Затем измеряют интенсивность ХЛ в растворе с неизвестной концентрацией антигена (A), повторяя те же процедуры, и по калибровочной кривой находят концентрацию A. При использовании метода ICMA (рис. 5, Б) берут избыток ХЛ-меченнного антигена (анти-А*) и добавляют к нему раствор с изучаемым веществом (A). Образуется ХЛ-меченнный иммунный комплекс:

A + анти-A* -> A-анти-A*

Остается отделить иммунные комплексы от других участников реакции и измерить интенсивность ХЛ. В данном случае она будет тем выше, чем меньше было анализируемого вещества A в пробе. Для количественного анализа и здесь предварительно строят калибровочную кривую. В обоих методах одна из практических трудностей – это очистка иммунных комплексов. Она решается также методами иммунохимии. Детали этой техники мы здесь рассматривать не будем, но один из подходов заключается, например, в использовании порошка сорбента (см. рис. 5, В), к поверхности которого "пришиты" (т.е. присоединены ковалентной химической связью) антитела к анти-А (назовем их анти-анти-А). В присутствии растворенных комплексов (А-анти-А и/или А*-анти-А) образуется тройной комплекс ("сандвич"): (анти-анти-А)-(анти-А)-А и/или (анти-анти-А)-(анти-А)-А*. Адсорбент можно осадить и затем определить в осадке (после дополнительных обработок) количество меченного антигена.

Биолюминесценция

Биолюминесценция (БЛ) – это свечение живых организмов, видимое простым глазом. Способностью к БЛ обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм реакций, сопровождающихся свечением, весьма различен у разных видов; однако обычно включает в себя химическое превращение определенного низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое ферментом, называемым люциферазой.

Биолюминесценция светляка

Всем известное свечение светлячков происходит в результате биохимической реакции окисления светлячкового люциферина кислородом воздуха в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты (ATP):

Здесь AMP – аденозинмонофосфат, PP – пирофосфат, E – люцифераза, LH₂ – люциферин, P* и P – продукт реакции (оксилюциферин) в возбужденном и основном состояниях, соответственно. В отсутствие АТФ биолюминесценция не наблюдается; на этом основан один из самых чувствительных методов анализа АТФ в различных объектах. Для определения содержания АТФ смотрят хемилюминесценцию в изучаемом растворе, к которому добавляют смесь люциферина и люциферазы, выделенных из светлячков либо полученных синтетически и методом генной инженерии. Удается определять содержание АТФ в образце от 10^-17 моля и выше. Поскольку биосинтез АТФ — показатель нормальной жизнедеятельности клеток, препарат люциферин — люцифераза светляка используют для обнаружения бактериального заражения в какой-либо среде, оценки жизнеспособности эритроцитов при консервировании крови, изучения действия на микроорганизмы антибиотиков и т. д. В последнее время используют препараты иммобилизованной люциферазы (т.е. фермента, молекулы которого химически связаны с полимерной пленкой), стабильность которой выше; такой препарат можно использовать многократно.