Использование активированной ХЛ в биохимических анализах

Обнаружение катализаторов, разлагающих перекись водорода с образованием свободных радикалов

Чистая перекись водорода с люминолом реагирует вяло, и хемилюминесценция при этом не наблюдается. Если перекись водорода разлагается ферментативным путем, например, при действии каталазы, свободные радикалы не образуются и свечение также не возникает. В присутствии ионов металлов переменной валентности, таких как железо, медь или марганец, а также некоторых их комплексов, например, производных гема, перекись водорода разлагается с образованием радикалов (гидроксила и супероксида) и возникает яркое свечение, связанное с реакциями люминола. По этой причине хемилюминесценция в присутствии люминола часто используется для определения в биологических средах малых количеств геминовых соединений, металлов переменной валентности, а также вообще способности биологического материала разлагать перекись водорода. Приведем два примера. У больных инфарктом миокарда в моче могут появиться очень небольшие количества миоглобина. Гем-содержащие соединения, к которым относится миоглобин, дают очень яркое свечение в присутствии перекиси водорода и люминола в сильно щелочной среде. Свечение мочи в этих условиях может служить одним из показателей инфаркта у больного (Барон, 1985, цит. По [1]). На поверхности свежей раны выделяется жидкость, называемая раневым экссудатом. В ней содержится каталаза – фермент, разлагающий перекись водорода без образования свободных радикалов. Наряду с этим жидкость содержит другие гем-содержащие белки и ионы железа, которые катализируют разложение перекиси водорода с образованием свободных радикалов кислорода, токсичных для клеток окружающей ткани. При добавлении к раневому экссудату перекиси водорода с люминолом наблюдается хемилюминесценция, тем более сильная, чем больше радикалов образуется при разложении перекиси. Таким образом, хемилюминесценция показывает, сколько токсичных радикалов образуется в экссудате. В свежей ране таких радикалов много, а по мере заживления их становится все меньше и меньшее. Ускорение заживления ран за счет применения лекарственных средств или облучения светом лазера сопровождается соответственным снижением хемилюминесценции экссудата. Таким образом, этот метод позволяет врачу контролировать эффективность лечения и вносить коррективы в сроки и дозы применения лечебных процедур [4].

Люминесценция фагоцитов

В рассмотренных случаях радикалы кислорода образовывались при разложении перекиси водорода, добавленной экспериментатором. Но живые клетки – фагоциты (к которым относятся гранулоциты и моноциты крови, а также тканевые макрофаги) сами образуют активные формы кислорода при их стимулировании. При этом наблюдается хемилюминесценция, особенно яркая в присутствии люминола (или люцигенина). На рис. 3 (А) в качестве примера показана хемилюминесценция клеток крови при действии на кровь кратковременных электрических импульсов, вызывающих увеличение проницаемости клеточных мембран и стимуляцию выделения клетками активных форм кислорода. Такие же "хемилюминесцентные ответы" можно получить, если добавить к лейкоцитам крови суспензию бактерий, изолированные оболочки дрожжевых клеток, кристаллы кварца или сульфата бария, а также определенные химические соединения; все эти агенты получили собирательное название "стимулов". Стимулированная ХЛ клеток в присутствии люминола – ценный показатель функционального состояния фагоцитов крови и тканей, их способности производить при необходимости активные формы кислорода, т.е. выполнять свою защитную функцию. Эта способность обычно усиливается при возникновении в организме очагов воспаления (например, после инфаркта миокарда) и в ряде других случаев. Наоборот, при длительном недостатке кислорода, связанном с общим ослаблением организма, активность фагоцитов и ХЛ-ответы снижаются. Два результата таких исследований даны в качестве примера на рис. 3 (Б) и 4. Как видно на рис. 3 (Б) у больных семейной гиперхолестеринемией (при этой наследственной болезни в крови содержится очень много холестерина и имеется выраженная предрасположенность к раннему развитию атеросклероза) ХЛ ответ клеток на стимул почти в четыре раза превышает ответ клеток здоровых доноров. Назначенное лечение – облучение крови ультрафиолетовым светом (УФ-ОК) оказалось малоэффективным, если верить данному показателю. В Институте Физико-химической медицины М. П. Шерстневым было проведено обследование большой группы больных различными заболеваниями (рис. 4). При затяжных хронических заболеваниях свечение клеток снижалось, тогда как при возникновении или обострении воспалительного процесса у больных происходило резкое увеличение активности клеток-фагоцитов. Так встречает организм инфекционную опасность – усиливается способность фагоцитов выделять активные формы кислорода для борьбы с чужеродными микроорганизмами. Хотя люминесценция люминола – весьма чувствительный метод обнаружения радикалов кислорода, метод не очень специфичен. Свечение наблюдается при действии на люминол не только радикалов гидроксила, но и при действии гипохлорита и ряда других окислителей. Заметный вклад в ХЛ-ответ клеток вносит выделение окиси азота: ингибитор NO-синтазы (фермента катализирующего образование окиси азота в клетках) уменьшает свечение почти вдвое. Большей избирательностью отличается люцигенин, свечение которого происходит при восстановлении красителя супероксидными радикалами. Это соединение часто используется для изучения образования супероксидных радикалов различными клетками и при биохимических реакциях "в пробирке".