Електрофоретичне розділення білків.

Метод заснований на тому, що молекули білка мають електричний заряд, величина і знак якого визначаються амінокислотним складом білка, рН та іонною силою оточуючого середовища. Під впливом зовнішнього електричного поля заряджені молекули пересуваються в розчині до протилежно зарядженого полюсу. Швидкість переміщення білкових частин

пропорційна величині їх заряду і зворотно пропорційна розміру частинок і

ступеню їх гідратації.

Широке розповсюдження в теперішній час отримав так званий «зональний електрофорез» – електрофорез на твердому носії (на паперових смугах, агарі, крохмалі, акриламіді), що просякнутий буферним розчином з потрібним значенням рН. Розташування білків на папері або гелі визначають шляхом фіксації і наступного забарвлення тим чи іншим барвником (звичайно бромфеноловим синім, амідовим чорним або кумасі синім). Кількість білка в кожній фракції можна орієнтовно визначати за інтенсивністю забарвлення зв`язаного барвника. Таке визначення не дає суворо кількісного співвідношення білкових фракцій, так як кількість барвника, зв`язаного різними білками неоднакова.

Виділяють:

- електрофорез на папері;

- електрофорез в агаровому гелі;

- електрофорез в поліакриламідному гелі.

Апарат для електрофорезу на плівці з ацетату целюлози (ЕПАУ – 20 – 50) призначений для розділення білків сироватки крові на плівках із ацетату целюлози. Апарат дозволяє виконувати електрофорез у мікроваріанті, що забезпечує значну економію реактивів і електроенергії. Устаткування складається із електрофоретичної камери, яка зроблена з органічного скла і джерела постійного струму. Експериментальний завод науково-дослідного інституту синтетичних смол виготовляє ацетатцелюлозні плівки необхідних розмірів; найзручніше використовувати плівки розміром 9×9 см, що дає можливість наносити послідовно від 4 до 7 зразків. Плівки витримують в розчині буферу, який застосовується для електрофорезу. Для одержання 5 фракцій рекомендується веронал-медіналовий буфер чи медінал-цитратний буфер рН=8,6. Для візуальної оцінки електрофореграм, а також прямого денситометрування, достатньо 1-2 мкл сироватки; елюювання фракцій з наступним фотометруванням потребує 3-4 мкл сироватки. Електрофоретичне розділення проводять при напрузі 200V на протязі 20хв. з подальшим виміром на денситометрі. Денситометр ДМ-1 призначений для фотометрування забарвлених фореграм, одержаних методом диск-електрофорезу.

ХРОМАТОГРАФІЯ

Хроматографія – метод розділення газів, парів, рідин і розчинних речовин на межі двох фаз – рухомої і нерухомої.

За механізмами розділення хроматографію поділяють на адсорбційну (газову або рідинну),осадову, іонообмінну, розподільчу, гель-фільтраційну (гель-хроматографію) і біоспецифічну (афінну); по формі проведення – на колонкову, хроматографію на папері і тонкошарову. Для фракціонування білків застосовується головним чином хроматографія на колонках.

Хроматографія на папері – один із видів розподільної хроматографії. Метод базується на різниці коефіцієнтів рухливості роздільних речовин між двома погано змішуваними розчинниками. В якості носія нерухомої фази використовують спеціальний хроматографічний папір. Він повинен бути хімічно чистим, однорідним по густині і забезпечувати визначену швидкість руху розчинника. Досліджувану речовину, що знаходиться в розчині, наносять у вигляді крапель на деякій відстані від краю на листок хроматографічного паперу. Папір розміщують в герметично закриту камеру і занурюють край листка, де був нанесений досліджуваний розчин, в кювету, що містить органічний розчинник. Лінія старту з нанесеними на неї пробами не повинна занурюватись в розчинник. За силами капілярності органічний розчинник буде рухатись вздовж листка хроматографічного паперу. Нанесена на папір речовина рухається за розчинником. Ступінь сорбції досліджуваної речовини на гідратованих волокнах паперу (повітряно-сухі листки фільтрувального паперу в камері, насиченої парами водонасиченого органічного розчинника, містить до 20% води) визначає швидкість його руху. Речовини, що гірше сорбуються на гідратованих волокнах паперу, будуть рухатися швидше. Після проходження фронтом розчинника певної відстані папір висушують і обробляють тою чи іншою проявляючою речовиною. Паралельно з дослідним розчином на цей листок паперу наносять стандартний розчин досліджуваної речовини (свідок), який буде вказувати місце знаходження речовини, що визначається. Для ідентифікації речовини можна також користуватися величиною Rf, яка являється відношенням відстані, яку дана речовина пройшла, до відстані, яку пройшов фронт розчинника. Велична Rf залежить від розчинника. Розрізняють висхідну (розчинник піднімається по паперу вверх) і низхідну (розчинник рухається вниз) хроматографію.