Фотометрія та фотометрична апаратура

Біохімічні аналітичні методи частіше всього закінчуються кольоровою реакцією, в результаті якої прозорий розчин набуває забарвлення, тобто здатність вибірково поглинати (адсорбувати) світло з певною довжиною хвилі. Для аналізу використовують тільки ті кольорові реакції, в яких розвивається забарвлення, пропорційне концентрації досліджуваної речовини. За допомогою фотометрії визначають екстинцію, або оптичну густину розчину. Більшість фотометричних приладів побудовано так, що вони безпосередньо вказують на цю величину.

Фотометричні прилади поділяються на 2-і великі групи: фотометри і спектрофотометри.

В фотометрах необхідні спектральні діапазони виділяються за допомогою світлофільтрів, тому число ділянок спектра, в якому може проводитись вимірювання, дорівнює числу світлофільтрів. В спектрофотометрах ділянки спектра виділяються за допомогою призм або дифракційних ґрат, тому можна встановити любу довжину хвилі в заданому діапазоні. Зазвичай спектрофотометри – це прилади більш високого класу, ніж фотометри, в них можна виділити більш вузьку (більше монохроматичну) ділянку спектра, проте все залежить від конкретної конструкції приладу.

Принцип роботи ФЕК

Фотоелектроколориметр застосовується для визначення концентрації забарвлених розчинів по їх здатності до світлопропускання (оптична густина).

Прилад працює від сітки перемінного струму через спеціальний постачальний пристрій. В якості джерела світла в приладі використовують лампу «Л» нажарювання (для роботи у видимій частині спектру) та ртутно-кварцеву лампу високого тиску (для вимірювання в ультрафіолетовій частині спектру).

В основу роботи приладу покладено принцип порівняння інтенсивності двох пучків світла при допомозі щілинної діафрагми «Д». Світлові пучки від лампи «Д» відображуються від дзеркала «З1» і «З2», проходять через світлофільтри «С1» та «С2», що забезпечують таку довжину хвилі, до якої фотоелементи найбільш чутливі, кювети «А1» та «А2» з досліджуваним забарвленим розчином і розчинником, а потім потрапляють на фотоелементи «Ф1» та «Ф2». Останні підключені до гальванометра. Внаслідок поглинання світла забарвленим досліджуваним розчином, що знаходиться в кюветі «А2», на фотоелемент «Ф2» буде потрапляти пучок світла меншої інтенсивності, ніж на фотоелемент «Ф1», і стрілка гальванометра буде відхилятися. Величину послаблення світлового потоку показує зв’язаний з щілинною діафрагмою «Д» відрахунковий барабан. Виражається вона в одиницях оптичної густини (екстинкціях), величина яких прямо пропорційна концентрації досліджуваної речовини в розчині.

Користуючись калібрувальним графіком, по екстинції відрахункового барабану визначають невідому концентрацію речовини в досліджуваному розчині. Для побудови калібрувальної кривої вимірюють оптичну густину ряду розчинів досліджуваної речовини з відомими концентраціями.

ФЛЮОРОМЕТРІЯ

Ефект флюоресценції полягає в тому, що досліджуваний об`єкт світиться під впливом опромінення світлом з більш короткою довжиною хвилі. Світло, що випромінюється, називається світлом флюоресценції або вторинним випромінюванням. Те світло, яким об`єкт опромінюється, називається світлом збудження флюоресценції або первинним.

Форма спектра флюоресценції звичайно дзеркально відображає форму спектра збудження, при цьому спектр збудження флюоресценції наближується до спектру поглинання розчину і тому характерний для даного флюорофора.

Під час флюорометрії довжина хвилі вторинного випромінювання, звичайно, встановлюється на максимум інтенсивності, так як цей вид випромінювання малоспецифічний, в той час як довжина хвилі первинного світла (збудження флюоресценції) повинна приходитись на найбільш специфічну для досліджуваної речовини ділянку спектру, що співпадає з максимумом (речовини, що заважають, можуть бути причиною хибного максимуму).

Фізичний ефект флюоресценції полягає в тому, що молекула речовини, яка досліджується, поглинає квант світла і при цьому переходить в більший енергетичний стан; через деякий проміжок часу вона випромінює надлишкову енергію у вигляді кванту світла флюоресценції (емісії). В зв`язку з тим, що енергія кванта світла обернено пропорційна довжині хвилі, довжина хвилі збуджуючого світла завжди коротша, ніж та, що випромінюється. Проміжок часу між поглинанням світла і його випромінюванням дуже малий, і в звичайних флуоресцентних методах на нього не звертають уваги, але він достатній, щоб на молекулярному рівні встигли пройти деякі зміни, зокрема, щоб молекула могла змінити своє розташування в просторі. На цьому заснований метод молекулярної віскозиметрії шляхом вимірювання зміни поляризації світла флюоресценції.

ПОЛУМ`ЯНА ФОТОМЕТРІЯ ТА АТОМНА АБСОРБЦІОМЕТРІЯ

Солі металів, потрапляючи в полум`я, здатні забарвлювати його. Це відбувається тому, що, при високій температурі полум`я, молекули розкладаються на окремі іони, електрони яких безперервно переходять із одного квантового стану в інший, що спряжено з випромінюванням чи поглинанням кванта світла. Мінімальна температура, яка необхідна для того,

щоб ці процеси проходили достатньо інтенсивно, залежить від природи досліджуваного елемента і в меншій мірі від того, в склад якої сполуки в розчині воно входить. Деякі елементи, наприклад, калій і натрій, починають

інтенсивно випромінювати світло, потрапляючи в полум`я з відносно низькою температурою, яке утворюється при згоранні метану в повітрі (так зване метаново-повітряне полум`я), а інші, наприклад кальцій, починають інтенсивно випромінювати світло і поглинати його лише при значно вищій температурі, яка утворюється при згоранні ацетилену. При згоранні метану (тобто побутового газу) на повітрі можна визначити кальцій лише після його попереднього виділення, але ця методика є складною, ненадійною і практично не використовується.

Метод, в якому вивчається забарвлення полум`я, тобто випромінювання, яке виникає в результаті переходу атома із енергетично більш високого стану в низький, називається полум`яною фотометрією. Можна вивчати і зворотній процес, тобто вимірювати поглинання світла при переході атома з більш низького на більш високий енергетичний рівень; цей метод називається атомною абсорбціометрією.

Апаратура, яка необхідна для полум`яної фотометрії, відносно проста і дешева, але метод виправдовує себе лише при дослідженні найбільш лекгосбудливих лужних елементів – літію, натрію, калію, так як можливо працювати з легкодоступним низькотемпературним полум`ям, яке утворюється при згоранні побутового газу. Хімічні методи визначення цих елементів складні і неточні, тому калій і натрій визначають в клінічних лабораторіях практично лише шляхом полум`яної фотометрії.

 

 

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ №2

Вуглеводи

А. Питання для підготовки з теоретичного матеріалу:

1. Визначення та функції вуглеводів.

2. Класифікація вуглеводів.

3. Моносахариди: класифікація, найважливіші представники моносахаридів, їх будова та біологічне значення.

4. Мутаротація моносахаридів. Проекції Фішера та Хеуорса на прикладі глюкози та фруктози.

5. Властивості моносахаридів як спиртів.

6. Властивості моносахаридів як альдегідів та кетонів.

7. Властивості моносахаридів як напівацеталей. Глікозиди.

8. Похідні моносахаридів: амінопохідні моносахаридів (гексозаміни, нейрамінова та сіалова кислоти); альдонові кислоти; уронові кислоти; аскорбінова кислота.

9. Поняття про олігосахариди.

10. Олігосахариди представники: мальтоза, сахароза, лактоза, целобіоза, рафіноза – будова.

11. Олігосахариди біологічне значення

12. Полісахариди: класифікація, найважливіші представники, їх будова та біологічне значення.

13. Будова, властивості, біологічне значення гомополісахаридів: крохмаль, глікоген, целюлоза.

14. Будова, властивості, біологічне значення гетерополісахаридів: гіалуронова кислота, хондроїтинсульфати, кератансульфати, гепарансульфати, гепарин, пектинові речовини.

15. Специфічні полісахариди мікробів.

16. Протеоглікани, глікопротеїни.

Б. Лабораторний практикум