ТЕМА 8. Исследование ферментативной активности почвы.

Разложение растительных остатков микроорганизмами обеспечивается гидролитическими ферментами, выделяемыми микробами в окружающую среду (экзоферменты). Под действием этих ферментов происходит распад органических веществ остатков на более простые соединения, растворимые в воде и поэтому, способные проникать в микробную клетку, где они используются как пищевые вещества.

Ферментативная активность характеризует активность микробных процессов в почве, связанных с численностью и активностью почвенного микронаселения.

 

 

Работа 8.1. Амилолитическая активность почвы

Амилолитическая активность почвы характеризует численность и активность почвенных микроорганизмов, использующих в качестве источника углеродного питания крахмал, попадающий в почву в составе растительных остатков. Амилолитические микроорганизмы разлагают крахмал с помощью амилазы до глюкозы, которая затем проникает в микробную клетку, где используется как источник углерода для биосинтезов и как энергетический субстрат.

Ход выполнения работы.

1. Из исследуемого почвенного образца берут две навески почвы массой по 5г и переносят их в 2 колбы. В одну приливают 20 мл 2% раствора крахмала и перемешивают (опытная колба). В другую 20 мл воды и перемешивают (контрольная колба). Колбы помещают в термостат на 2-5 дней при температуре 25⁰С.

2. После окончание срока инкубации в опытную колбу добавляют 20 мл воды, а в контрольную - 20 мл 2% раствора крахмала. Содержимое колб перемешивают и фильтруют. В фильтрате (опытного и контрольного вариантов) проводят качественную йодокрахмальную пробу на обнаружение крахмала. Для этого к 5 мл исследуемого фильтрата добавляют 3-5 капель раствора йода и перемешивают. При наличии крахмала развивается синяя окраска раствора (положительная реакция), а при отсутствии - окраска не развивается (отрицательная реакция). По интенсивности окраски можно судить о количестве крахмала в растворе: чем интенсивней окраска, тем содержание крахмала больше.

3. Сравнивают результаты йодокрахмальной пробы в контрольном варианте с аналогичным результатом в опытной колбе (при этом следует учесть, что контрольный вариант характеризует исходное содержание крахмала в инкубационной смеси, а опытный вариант - конечное содержание крахмала в инкубационной смеси). Если при этом в опытном варианте окраска не развивается (или её интенсивность меньше, чем в контрольном варианте), то делают вывод о наличии амилолитической активности в почве; если же интенсивность окраски в опытном и контрольном вариантах одинакова, то это свидетельствует об отсутствии амилолитической активности в исследуемой почве.

Записи при выполнении работы

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

 

 

Работа 8.2. Протеолитическая активность почвы

 

Протеолитическая активность характеризует активность разложения белков (протеина) почвенными микробами. Процесс разложения белков осуществляется путем их гидролитического распада ферментом протеазой до аминокислот, от которых впоследствии отщепляется аминная группа в виде аммиака. Далее углеродный «скелет» аминокислот используется микробами в качестве источника углеродного питания, а аммиак остается в среде обитания микробов в виде ионов аммония. Количество накопленного в среде аммонийного азота и характеризует протеолитическую активность почвы.

Ход выполнения работы.

1. Из среднего образца почвы отбирают аналитическую пробу массой 5г переносят в колбу и прибавляют 1г мелко измельченных семян бобовых растений (горох, люпин), после чего в колбу приливают 20 мл воды. Содержимое перемешивают и помещают в термостат на 5-7 дней при температуре 25-27⁰С. Аналогичным образом готовят контрольную пробу, но измельченные семена в инкубационную смесь не вносят.

2. При снятии опыта в опытную колбу добавляют 20 мл воды, взбалтывают, дают отстояться, после чего фильтруют. В контрольную колбу вносят 1г измельченных семян бобовых, 20 мл воды, перемешивают и фильтруют. Далее проводят качественную реакцию обнаружения аммонийного азота в фильтрате опытного и контрольного вариантов. Для этого около 10 мл исследуемого фильтрата переносят в пробирку, добавляют 1 мл реактива Несслера и перемешивают. При наличии аммонийного азота развивается желто-коричневая окраска (положительная реакция), интенсивность которой пропорциональна количеству аммонийного азота в растворе. При отсутствии аммонийного азота окраска не развивается (отрицательная реакция).

3. Сравнивают интенсивность окраски раствора опытного варианта (который характеризует конечное содержание аммонийного азота в инкубационной смеси) с окраской раствора контрольного варианта (последний характеризует исходное содержание аммонийного азота в инкубационной смеси). Более интенсивная окраска раствора опытного варианта по сравнению с контролем свидетельствует о наличии протеолитической активности в исследуемой почве; если же интенсивность окраски растворов одинакова, то делают вывод об отсутствии протеолитических процессов в почве.

Записи при выполнении работы.

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Контрольные вопросы

1. Какие ферменты называют гидролитическими? Какой фермент, осуществляет гидролиз крахмала, белков? Каковы продукты гидролиза белков и крахмала?

2. Как определяют протеолитическую и амилолитическую активность почвы?

3. Как проводят качественную реакцию на крахмал и аммонийный азот в инкубационной смеси?