Задачи инженерной энзимологии.

Инженерная энзимология – это отрасль биотехнологии, которая базируется на использовании каталитических функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном состоянии или в составе живых клеток для получения соответст­вующих целевых продуктов. Биообъект здесь – фермент (или комплекс ферментов).

Развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной чистых ферментных препаратов, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использова­ния. Принципиально новые перспективы открылись перед при­кладной энзимологией в 60-е годы XX в. в результате появления на стыке химии и биологии новой отрасли – инженерной энзи­мологии.

Одним из первых в мире кто почувствовал широкие возможности использования ферментов для решений задач технической химии, медицины, сельского хозяйства был Илья Васильевич Березин, профессор кафедры химической кинетики МГУ. Его можно назвать одним из основоположников современной инженерной энзимологии. В результате деятельности И.В. Березина и его учеников стало очевидным, что ферментные катализаторы могут быть использованы во всех направлениях современной химии: органической (тонкий и тяжелый органический синтез), физической (термодинамика и термохимические исследования), электрохимии (использование явления биоэлектрокатализа – ускорения ферментами электродных реакций), аналитической химии (микроанализ, иммуноферментный и биолюминесцентный анализы, в биосенсорах), фотохимии (светочувствительные реакции с участием ферментов).

Задачи инженерной энзимологии заключаются в развитии прогрессивных мето­дов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации; конструировании катализаторов с нужными свойствами и разработке научных основ их применения.

На практике обычно используют иммоби­лизованные ферменты (реже – иммобилизованные клетки), бла­годаря чему стабилизируется и пролонгируется их ферментативная активность.

В частности, методами белковой инженерии, сущность которых состоит в изменении первичной структуры природной молекулы фермента посредством химической модификации самого энзима или его гена, удается принципиально трансформировать структуру активного центра и его функцию, модулировать субстратную специфичность и физико-химические свойства фермента. Так, замена остатка глутамина-102 в молекуле лактатдегидрогеназы на аргинин превратила фермент в высокоактивную малатдегидрогеназу. Описанным способом получены термостабильные формы лизоцима Т-4 и субтилизина (каталитическая константа субтилизина изменена в 100 раз), созданы гибридные формы фер­ментной системы, ценной в иммуноферментном анализе, сочета­ющие в себе свойства β-галактозидазы и β -галактокиназы.

Многие проблемы технологии синтеза органических соедине­ний, пищевой и медицинской промышленности, мониторинга че­ловека и окружающей среды, защиты окружающей среды, энер­гетики не могут быть решены без использования методов совре­менной инженерной энзимологии.

Важным этапом развития инженерной энзимологии стала раз­работка способов получения и использования иммобилизованных ферментов.

 

 

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

 

Иммобилизованными ферментами называются ферменты, ис­кусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраня­ющие свои каталитические свойства.

В1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осу­ществили ковалентные связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем.

В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно – полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул.

По сравнению с нативными ферментами иммобилизованные имеют ряд преимуществ:

1. Представляя собой гетерогенные катализаторы, легко от­деляются от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.

2. Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта.

3. Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.

Так, происходящая при температуре 65°С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60 %-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным фер­ментом.

4. Можно регулировать каталитическую активность путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук.

5. Иммобилизованные ферменты долговеч­ны и стабильнее свободных энзимов.

Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использу­ющих иммобилизованные ферменты.

Для осуществления химических процессов с помощью иммо­билизованных ферментов применяют колоночные, трубчатые, пла­стинчатые и танкерные реакторы разного объема и производи­тельности. Иммобилизованные ферментные системы функциони­руют в биореакторе в виде неподвижной фазы, через которую про­текает среда с субстратом, подлежащим химическому превраще­нию (гетерогенный катализ). В таких реакторах наряду с непрерыв­ным режимом используется и периодический. Для эффективного перемешивания и газообмена биореактор снабжают мешалкой. По­вреждающее действие мешалки на биокатализатор устраняют, зак­репляя определенным образом его гранулы. Например, в биореак­торе «корзиночного» типа мешалка вращается в полом цилиндре из сетчатой структуры (корзина), в ячейках которой закреплен им­мобилизованный фермент. Во внутреннем объеме трубчатых реак­торов рыхло расположены полые волокна, заполненные биоката­лизатором. Степень превращения субстрата в продукт (например, фумарата аммония в аспартат) в таких реакторах достигает 90 %.