Менингококка, в то время как колонии гонококка имеют цвет среды

или являются беловатыми.

Гонококки и менингококки не растут на простых питательных

средах, причем наиболее требователен к составу питательной среды,

гонококк, особенно при первичном посеве от больного. Ряд других

признаков представителей рода Neisseria и Branhamella, которые

могут быть выделены со слизистой оболочки человека (миндалин и

глотки у взрослых, а также мочеполового тракта у детей и реже у

взрослых) приведены в таблице.

 

Таблица

 

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ КОККОВ

 

+---------------------------------------------------------------+

| | Образование кислоты из: |Нали-|Потреб-|Рост|

| Микроорганизмы |---------------------------|чие |ность в|при |

| |глю-|маль-|фрук-|саха-|лак-|пиг- |СО2 |22ё |

| |козы|тозы |тозы |розы |тозы|мента| | |

|----------------+----+-----+-----+-----+----+-----+-------+----|

|N. gonorrhoeae | + | - | - | - | - | - | // | - |

|N. meningitidis | + | + | - | - | - | - | / | - |

|N. sicca | + | + | + | + | - | х | * | х |

|N. flava | + | + | + | - | - | + | * | х |

|N. subflava | + | + | +- | +- | - | + | * | х |

|N. perflava | + | + | + | + | - | + | * | х |

|N. flavescens | - | - | - | - | - | + | * | + |

|N. mucosa | + | + | + | + | - | - | * | + |

|B. catarrhalis | - | - | - | - | - | - | * | + |

+---------------------------------------------------------------+

Обозначения:

+ большинство штаммов дает положительный результат

(90%);

- большинство штаммов дает отрицательный результат

(90%);

+- признак непостоянный у одного и того же штамма;

х некоторые штаммы дают положительный, некоторые

отрицательный результат;

/ важна;

* не обязательна.

 

Невозможность получения роста гонококков и менингококков на

МПА без обогащающих среду ингредиентов и температуре 22ё может

быть использована при идентификации выделенных грамотрицательных

кокков.

Дифференциальный диагноз между гонококком и менингококком

бывает труден, когда образование кислоты из глюкозы и мальтозы

выражено слабо или отсутствует. В этих редких случаях может помочь

определение гемолитических свойств выделенных культур путем посева

их на МПА с 5% крови лошади. Наличие зон гемолиза вокруг колоний

после 48-72 часов инкубации посева указывает на выделение

менингококка.

Для определения сахаролитических свойств грамотрицательных

кокков следует использовать среду ферментации ЦКВИ.

Основой среды является МПА из кроличьего мяса или бычьих

сердец, приготовленный по ранее описанной методике, рН=7,4-7,5. В

каждую из пяти колб со 100 мл расплавленного в кипящей водяной

бане и охлажденного до 56ё МПА добавляют смесь, состоящую из 15 мл

желтка свежего куриного яйца и 1,5 г одного из следующих сахаров:

глюкозы, мальтозы, фруктозы, сахарозы, лактозы, растворенных в 2

мл дистиллированной воды и простерилизованных кипячением в водяной

бане в течение 15 минут, а также 6 мл 0,2% раствора фенолового

красного водорастворимого. Перемешивают, разливают по 20 мл в

стерильные чашки Петри. Среду можно хранить в холодильнике при 4ё

в течение одного месяца.

Приготовление индикатора: 2 г фенолового красного

водорастворимого добавляют к 1 л дистиллированной воды, доводят рН

до 7,8, используя 20% раствор едкого натрия, стерилизуя в

автоклаве при 120ё в течение 20 минут.

Посев чистой культуры подлежащего дифференциации

грамотрицательного кокка производят на поверхность среды

ферментации, предварительно подогретой в термостате, в виде двух

взаимоперпендикулярных штрихов длиною 1 см. На поверхность среды в

одной чашке Петри можно посеять от 1 до 5 испытуемых штаммов.

Чашки с посевами помещают в эксикатор с влажной ватой на дне, но

без создания в нем повышенного содержания углекислого газа.

Результаты реакции учитывают через сутки. Положительным

считают изменение красного цвета среды на желтый в зоне роста

микроорганизмов под действием их сахаролитических ферментов. При

отсутствии этого действия среда остается красной или становится

вишневой, что регистрируется как отрицательный результат.

ЦКВИ разработана также более экономичная модификация

указанного способа определения сахаролитических свойств

грамотрицательных кокков, которую удобно использовать при изучении

малого числа штаммов. При применении данного способа растворы всех

пяти сахаров наносят на поверхность среды в одной чашке, что

позволяет изучать сахаролитические свойства одного штамма при

наличии одной чашки со средой. При изготовлении среды для данной

модификации к МПА добавляют только желток свежего куриного яйца в

соотношении, указанном выше. Чашки Петри, в которые разливаются

среды, должны быть установлены на горизонтальной поверхности.

Хранение среды в чашках допускается в течение одного месяца в

xoлoдильнике при 4ё.

Перед использованием среду нагревают в термостате, после чего

дно чашки с внешней стороны делят на пять секторов и чашки

устанавливают на горизонтальной плоскости. На поверхность среды

каждого сектора стерильной пастеровской пипеткой наносят по одной

капле 80% раствора одного из пяти вышеуказанных сахаров,

растворенных в 0,2% стерильном растворе фенолового красного

водорастворимого, приготовленного как указано выше. Эти растворы

сахаров стерилизуют кипячением в водяной бане в течение 15 минут.

Неиспользованные растворы можно хранить в холодильнике при 4ё в

течение одного месяца.

Посев испытуемой культуры производят на все пять секторов в

одной чашке в зоне нанесения растворов сахаров, после того как

произойдет диффузия их в среду.

Инкубация посевов и учет результатов осуществляется как

указано выше.

Добавление к среде ферментации антибиотиков, согласно

методическим указаниям, способствует сохранению стерильности среды

при хранении и препятствует загрязнению изучаемых культур при

посеве их на среду ферментации.

 

Определение чувствительности гонококков к антибиотикам

 

При безуспешном лечении гонореи возникает необходимость

определения чувствительности гонококка к антибиотикам. С этой

целью используют метод диффузии в агар с применением стандартных

бумажных дисков, пропитанных антибиотиками. Асцит-агар или

безасцитную питательную среду разливают в чашки Петри. На ее

поверхность наносят 1 мл взвеси суточной чистой культуры гонококка

в изотоническом растворе хлорида натрия (густота взвеси 10 ЕД по

оптическому стандарту мутности), которую стеклянным шпателем

равномерно распределяют но поверхности среды, выдерживают 15 минут

при комнатной температуре, избыток взвеси удаляют с помощью

пипетки. Затем на поверхность среды помещают бумажные диски с

антибиотиками, применяемыми для лечения гонореи. Чашки в

эксикаторе выдерживают в термостате 1-2 суток. При оценке

результатов измеряют в мм диаметр зон полной задержки роста

гонококка вокруг дисков, включая их диаметр. Отсутствие зон

указывает на отсутствие чувствительности, зон диаметром до 10 мм

- на малую чувствительность, более 10 мм - на чувствительность

испытуемых штаммов гонококка к концентрации антибиотика в

стандартных дисках, причем чем больше зона, тем выше

чувствительность.

Использование смешанных культур для определения

чувствительности гонококка к антибиотикам не допустимо.

При микроскопическом обнаружении большого числа гонококков в

патологическом отделяемом возможен непосредственный посев

отделяемого на среду в чашках Петри с последующим наложением

дисков с антибиотиками. При этом берут густую взвесь отделяемого в

1 мл изотонического раствора, равномерно распределяют ее шпателем

по поверхности среды, причем избыток не удаляют, а ожидают полного

всасывания взвеси в среду. В остальном исследование проводят

аналогично ранее описанному.

 

Определение бета-лактамазной активности гонококка

 

В последние годы все шире распространяются штаммы гонококка,

продуцирующие бета-лактамазу, которая инактивируя пенициллин,

обусловливает безуспешность лечения больных гонореей этим

антибиотиком. Выработку гонококком бета-лактамазы определяют

чашечным способом, при котором к стерильной основе питательной

среды для выделения гонококка, расплавленной в водяной бане и

охлажденной до 45ё, добавляют помимо обогащающих веществ взвесь

стафилококка, чувствительного к пенициллину. Для этого из суточной

культуры стафилококка готовят взвесь в стерильном изотоническом

растворе густотой 5 ЕД по оптическому стандарту мутности, затем

эту взвесь разводят еще в 10 раз, берут 6 мл взвеси и добавляют к

100 мл среды. Среду со взвесью перемешивают и разливают по

стерильным чашкам Петри. На застывшую среду в центр чашки помещают

стандартный диск с пенициллином и от него по радиусам до края

чашки засевают в виде линий испытуемые микроорганизмы. При

использовании 1 чашки можно исследовать 4-5 штаммов. При

проведении данного исследования необходимо иметь штамм любого

микроорганизма, продуцирующий бета-лактамазу (положительный

контроль). Чашки Петри с посевами помещают в термостат при 36-37ё.

Через сутки среда прорастает стафилококком (рис.1.3)<*> за

исключением зоны задержки роста (рис.1.2)<*> вокруг диска

(рис.1.1.)<*>. Микроорганизмы, не продуцирующие бета-лактамазу,

вырастают в виде полосы, не изменяя очертаний зоны задержки роста

стафилококка (рис.1.7.)<*>. При выработке штаммом бета-лактамазы

она нейтрализует бензилпенициллин, диффундирующий в питательную

среду из диска, в результате чего по краям линии роста этого

микроорганизма по направлению к диску наблюдается рост

стафилококка внутри среды, что приводит к искривлению очертаний

зоны задержки роста (рис.1.5.)<*>. Если штамм не продуцирует

бета-лактамазу, но чувствителен к бензилпенициллину, то он

вырастает до зоны задержки роста (рис.1.4)<*>. Микроорганизмы,

продуцирующие стафилоцин, который губительно действует на

стафилококк, при своем росте образуют полосу просветления в газоне

(рис.1.6.)<*>. По степени искривления зоны задержки роста судят о

количестве вырабатываемой испытуемым штаммом бета-лактамазы.

--------------------------------

<*> - Рисунки не приводятся.

 

Следует учесть, что при пересевах гонококк может потерять

способность продуцировать бета-лактамазу.

 

Организационные вопросы

 

Лаборатория, осуществляющая бактериологическую диагностику

гонореи, должна иметь бокс с предбоксником, комнату для мытья

посуды, отдельные помещения для взятия материала от больных и его

обработки, для микроскопического исследования мазков и культур,

подготовки лабораторной посуды, а также для приготовления

питательных сред и их стерилизации. Лаборатория должна быть

обеспечена термостатами, сушильными шкафами, холодильниками,

автоклавами, инактиваторами, центрифугами, инструментарием,

лабораторной посудой, а также необходимыми реактивами и

ингредиентами для окраски и приготовления питательных сред.

Работа с живыми культурами микроорганизмов требует строгого

соблюдения правил личной и общественной безопасности при ее

выполнении. Все предметы, которые были использованы при работе с

патологическим материалом или живыми культурами (петли, пипетки,

пробирки, предметные стекла и др.) немедленно обеззараживают

прожиганием на пламени, либо погружением в дезинфицирующий

раствор, либо автоклавированием. Работу с живыми культурами

микроорганизмов производят только в боксе, его не используют для

приготовления стерильных питательных сред. Стены и потолок бокса

должны быть выкрашены масляной краской, пол выложен плиткой или

покрыт линолеумом, столы обиты легко моющимися материалами. В

боксе необходима бактерицидная лампа, на рабочих местах - банки с

дезинфицирующим раствором, желательна газовая горелка, которая

может быть заменена спиртовой. В предбокснике ставят шкафы для

спецодежды и стерильной посуды, необходимых для работы в боксе.

Ежедневно до работы и после нее бокс обрабатывают дезинфицирующими

растворами и облучают бактерицидной лампой.

Бактериологический контроль на загрязненность бокса должен

проводиться не менее одного раза в неделю. Для этого на 15 минут

оставляют на столе открытыми чашки Петри с мясопептонным агаром

(МПА) и средой Сабуро, затем первую чашку инкубируют в течение 48

часов при 37ё, вторую - 96 часов при 22ё. Допускается рост не

более 10 колоний сапрофитных микроорганизмов.

Известно, что правильная организация лабораторных

исследований, их высокое качество помогает раннему распознаванию и

своевременному лечению гонореи и трихомониаза, решение вопросов

излеченности больного и, тем самым, создают условия для более

эффективной борьбы с распространением этих заболеваний, для

правильности их учета.

Бактериологическая диагностика является одним из важных

звеньев в борьбе с распространением заболеваемости гонореей и

трихомониазом, так как эффективная организация и проведение

лечебно-профилактических и противоэпидемических мероприятий без

этого чувствительного и специфического метода выявления

возбудителя невозможны. Основным этапом бактериологической

диагностики является первичное выделение возбудителя инфекции,

которое осуществляется путем культивирования на питательной среде

исследуемого отделяемого пораженных органов, содержащего

микроорганизмы. Поэтому надежность исследований и, соответственно,

эффективность работы бактериологической лаборатории в значительной

мере зависит от качества исследований. Получение точных и

достоверных результатов может быть достигнуто лишь при оптимальном

числе проведенных исследований в единицу времени, увеличение их

приводит к стремлению каждым работником быстрее провести каждое

исследование, повышению утомляемости и, естественно, к снижению

качества исследования, а в результате возможности гиподиагностики

заболевания. Оптимальные условия для работы бактериологической

лаборатории достигаются в том случае, когда каждый работник

выполняет исследования в соответствии с нормами затрат рабочего

времени, полагающегося для производства данного исследования.

 

…

 

При распределении времени между врачом-лаборантом (заведующим)

и лаборантом настоящие нормы предусматривают, что при

непосредственном выполнении исследований врач-лаборант выполняет

следующие манипуляции: микроскопирование мазков патологического

материала, взятого из очагов и окрашенного метиленовым синим и по

Граму, и мазков из культур, окрашенных по Граму, для обнаружения

возбудителей гонореи и трихомониаза с регистрацией результатов

исследования в бланке; макроскопическое изучение выросших культур,

а также постановка оксидазного теста; микроскопирование выросшей

культуры в нативном препарате для обнаружения возбудителя

трихомониаза с регистрацией результатов исследований в бланке;

пересевы колоний гонококка и выделение его чистой культуры;

пересев культур влагалищных трихомонад в свежую питательную среду;

определение чувствительности чистых культур гонококков к

антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков;

контроль работы лаборантов, обучение их; контроль работы

лабораторий, занимающихся диагностикой гонореи и трихомониаза, в

курируемых учреждениях, подготовка кадров в них. Все остальные

манипуляции выполняются лаборантами под контролем врача-лаборанта

(заведующего). Данное распределение обязанностей не исключает

взаимозаменяемости в тех случаях, когда это диктуется

необходимостью или условиями работы.

 

 

Серологический метод исследования (реакция Борде-Жангу)(РСК)

 

Принцип. Специфические антигонококковые антитела вступают в

соединение со специфическим антигеном (убитая культура гонококка,

содержащая 3 млрд микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту).

Образовавшиеся комплексы сорбируют вводимый в реакцию комплемент.

Индикация образовавшихся комплексов достигается введением

гемолитической системы (эритроциты барана+гемолитическая

сыворотка). Применяется для выявления больных гонореей, в основном

при хронических и осложненных формах заболевания.

… …

 

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ТРИХОМОНИАЗА

 

В связи с широким распространением мочеполового трихомониаза

среди населения и наличием трудно диагностируемых хронических и

торпидно протекающих форм этого заболевания большое значение

приобретает правильное применение с диагностической целью

существующих лабораторных методов исследования.

Основными очагами трихомонадной инвазии являются

мочеиспускательный канал у мужчин, влагалище, цервицервикальный

канал, уретра у женщин. Последняя поражается не менее, чем у

половины больных, нередко наблюдается изолированное воспаление

уретры. У мужчин, кроме уретры, трихомонады могут вызывать

воспаление предстательной железы, семенных пузырьков, придатков

яичек, куперовых желез, мочевого пузыря; восходящая, инфекция

мочевых путей (пиелонефриты и пиелиты) встречается реже. В

воспалительный процесс у женщин часто вовлекаются большие

вестибулярные железы, ходы Скене, мочевой пузырь и область

Льетодиева треугольника. Влагалищные трихомонады могут проникать в

полость матки. В отдельных случаях их находят в сактосальпинксах и

кистах яичников.

Таким образом, как и гонорея, мочеполовой трихомониаз

протекает по типу многоочагового заболевания, поэтому исследования

на трихомонады необходимо проводить из всех возможных очагов

поражения.

Клинический диагноз трихомониаза во всех случаях должен быть

подтвержден обнаружением типичных форм влагалищных трихомонад при

лабораторном исследовании.

У мужчин из мочеиспускательного канала материал для

исследования на трихомонады берут после 4-5 часовой задержки мочи.

Ввиду того, что в свободно стекающей капле из уретры трихомонады

удается обнаружить сравнительно редко, необходимо исследовать

отделяемое после удаления свободно стекающей капли, а также

центрифугат свежевыпущенной первой порции мочи. Лучшие результаты

получают при исследовании материала, взятого при соскобе со

слизистой уретры с помощью ложки Фолькмана, тупой ушной ложки или

желобоватого зонда.

У женщин материал для исследования берут путем соскоба со

стенок влагалища в области заднего свода, а также из уретры с

помощью легкого поскабливания переднебоковых стенок ложкой

Фолькмана, тупой ушной ложкой или желобоватым зондом,

предварительно смоченных изотоническим раствором натрия хлорида. У

девочек патологический материал берут из глубины влагалища также с

помощью ложки, введенной через отверстие в девственной плеве.

Для повышения качества лабораторной диагностики трихомониаза

необходимым условием является прекращение применения

противотрихомонадных средств за 7-10 дней до взятия материала.

Даже однократное спринцевание или введение противотрихомонадных

препаратов может обусловить отрицательные результаты исследования.

Для лабораторной диагностики трихомониаза применяются

следующие методы: 1) микроскопическое исследование нативного

препарата; 2) микроскопическое исследование окрашенного препарата;

3) культуральное исследование путем посева на питательную среду.

 

Микроскопическое исследование нативного препарата

 

При исследовании нативных препаратов материал наносят на

слегка подогретое предметное стекло, смешивают с каплей теплого

изотонического раствора натрия хлорида, накрывают покровным

стеклом и исследуют в микроскопе с объективом 40 и окуляром 10Х.

Ввиду того, что при длительном пребывании препаратов при комнатной

температуре трихомонады довольно быстро теряют подвижность,

исследование следует проводить непосредственно после получения

материала.

В нативных препаратах влагалищная трихомонада узнается по

грушевидной или овальной форме тела величиной немного большей

лейкоцита, характерным толчкообразным движениям и жгутикам,

которые особенно хорошо видны при исследовании в микроскопе с

темнопольным или фазовоконтрастным конденсором.

При исследовании нативных препаратов влагалищные трихомонады

иногда смешивают со жгутиковыми семейства бодонидов, которые могут

быть занесены в препарат из воды, загрязненной посуды и т. д. В

отличие от трихомонад, бодониды имеют лишь 2 жгутика и очень

быстро двигаются по прямой. К ошибкам может привести и наличие в

препарате подвижных бактерий, которые, прикрепляясь к лейкоцитам,

создают впечатление наличия большого количества подвижных

трихомонад.

 

Микроскопическое исследование окрашенного препарата

 

Преимуществом исследования трихомонад в окрашенных препаратах

является возможность изучения их спустя длительное время после

взятия материала. В повседневной практике наиболее широко

применяют окраску высушенных на воздухе и фиксированных препаратов

1% раствором метиленового синего или по способу Грама, что

позволяет выявлять трихомонады при одновременном исследовании

мазков на гонококки. Хорошие результаты получают при использовании

для окраски препаратов 0,5% водного раствора бриллиантового

зеленого.

В окрашенных препаратах метиленовым синим или по Граму,

трихомонады имеют овальную, круглую или грушевидную форму с хорошо

выраженными контурами и нежноячеистым строением цитоплазмы, ядро

расположено эксцентрично, интенсивно окрашено.

Для выявления более тонкого строения трихомонад применяют

более сложные методики окраски препаратов (по Романовскому-Гимза,

Лейшману-Романовскому), которые позволяют видеть жгутики,

ундулирующую мембрану и т.д. По Романовскому-Гимза мазки

окрашивают в течение 1 часа 5% раствором азурэозина в

дистиллированной воде. Окраску препаратов по Лейшману-Романовскому

производят следующим образом. Краску Лейшмана (0,25 г сухого

порошка краски, 25 мл метилового спирта, 12,5 мл глицерина)

наносят на нефиксированный мазок и оставляют в течение 20-30

секунд, после чего смывают водопроводной водой и докрашивают по

Романовскому-Гимза (1 мл азурэозина растворяют в 30 мл

дистиллированной воды, раствор краски готовят ex tempore) в

течение 1 часа, после чего краску смывают водопроводной водой.

Окрашенные препараты высушивают на воздухе.

Значительно повышают выявляемость трихомонад повторные

анализы, в частности, с использованием провокации, а также

применение культурального метода в комплексе с другими методами

исследования. При обследовании на трихомониаз применяют только

алиментарный (острая, соленая пища) и механический (массаж на

буже, металлический колпачок на шейку матки) способы провокации;

инстилляции и смазывания препаратами серебра и раствором Люголя не

проводят, так как последние губительно действуют на влагалищную

трихомонаду и затрудняют ее обнаружение. Мазки, в которых

обнаружены трихомонады, должны сохраняться в лаборатории 3 месяца.

 

Культуральный метод исследования

 

Наиболее широкое распространение для культуральной диагностики

трихомониаза получили питательные среды, в состав которых входят

асцитическая жидкость, солянокислый цистеин, сыворотки крови,

пищевой белок (мясо, печень) и т. д. Общим недостатком таких сред

является нестандартность их основы, трудоемкость приготовления,

дефицит составных частей и ограниченные сроки хранения.

В ЦКВИ было разработано 4 варианта жидкой питательной среды из

стандартных ингредиентов, используемых при изготовлении

безасцитных питательных сред для выделения гонококков.

Особенностью этой среды является возможность изготовления

непосредственно перед употреблением.

 

Рецепты среды

 

… …

При выращивании на жидких питательных средах влагалищные

трихомонады дают придонный рост в виде плотного беловатого осадка,

из которого пастеровской пипеткой берут материал для исследования

в нативном препарате. Микроскопическое исследование культур

следует производить на 3-5, а при отрицательных результатах -

повторно на 7-9 и 11-17 день после посева, т.к. длительность цикла

развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от величины

посевной дозы.

Названные в данных указаниях методы исследования в диагностике

гонореи и трихомониаза унифицированы<*>, обязательны к применению,

использование модификаций недопустимо.

-------------------------------

<*> - Приказ Минздрава СССР N 936 от 12 июля 1985 года "Об

унификации лабораторных методов исследования в диагностике гонореи

и трихомониаза".

 

Контроль за качеством бактериологических и других исследований

для диагностики гонореи и трихомониаза возложен на соответствующие

лаборатории и республиканские научно-исследовательские

кожно-венерологические институты и республиканские, областные

(краевые) кожно-венерологические диспансеры<*>.

-------------------------------

<*> - Приказ Минздрава СССР N 575-ДСП от 20 июня 1977 года "О

дополнительных мероприятиях по усилению борьбы с венерическими

заболеваниями".

 

Методика осуществления контроля изложена в "Методических

рекомендациях по организации контроля качества бактериоскопических

и бактериологических исследований на гонорею", N 10-8/20,

утвержденных Минздравом СССР 23 марта 1979 года.

 

Начальник Главного управления

лечебно-профилактической помощи

А.М.МОСКВИЧЕВ

http://www.webapteka.ru/phdocs/doc6564.html