Него опускают 3,8 г бикарбоната натрия, дают возможность

образовавшемуся газу вытеснить из эксикатора воздух, после чего

притирают крышку, края которой предварительно смазывают вазелином

и ланолином 1:1. Выращивание производят в термостате при 36-37ё.

 

 

Выросшую культуру исследуют макро- и микроскопически: изучают

вид колоний и отмечают подозрительные на гонококки, готовят из них

и другой флоры мазок, который окрашивают по способу Грама и

микроскопируют.

Колонии гонококков чаще вырастают в течение 1-2 суток, поэтому

обязательным является исследование культур на следующий день после

посева. Однако наблюдается и более поздний рост, особенно при

посеве патологического материала из цервикального канала, что по

мнению одних исследователей объясняется расположением гонококка

внутри слизи, других - наличием в посевном материале его Л-форм,

трансформация которых происходит медленно. В связи с этим, если

питательная среда не зарастает сопутствующей флорой, ее

выдерживают в термостате до 8 суток с обязательным ежедневным

просмотром.

Колонии гонококка имеют круглые очертания, ровные края,

блестящую поверхность, прозрачны или слегка мутные, бесцветны. При

снятии колоний с поверхности среды петлей и при получении

суспензии гонококков в изотоническом растворе натрия хлорида или

водопроводной воде с целью получения мазков из культур на

предметном стекле определяется их слизистая консистенция.

При бактериологической диагностике гонореи большое значение

имеет правильная окраска мазков из культур по способу Грама и

квалифицированное их исследование. Критерием правильной окраски

культур является наличие недообесцвеченных участков в толстых

местах мазка. При этом, при правильной окраске, в центре скоплений

из оранжево-красных микроорганизмов наблюдаются группы кокков или

отдельные участки мазка, окрашенные в фиолетовый цвет.

При исследовании мазков из культур необходимо учитывать

морфологию, расположение и окраску гонококков. Они представляют

собой, главным образом, не парные, а отдельные кокки, собранные в

скопления с более плотным центром и как бы рассыпанные

беспорядочно по периферии. Наряду с интенсивно окрашенными в

оранжево-розовый цвет кокками встречаются бледно окрашенные формы,

а также особи неправильно округлых очертаний. Полиморфность

гонококков увеличивается по мере старения культуры. Гонококки не

образуют в культуре цепочек и гроздей, что свойственно

стрептококкам и стафилококкам. Следует отметить, что нередко

встречаются штаммы стрептококка и стафилококка, легко теряющие

свою первоначальную фиолетовую окраску при обесцвечивании спиртом,

и в процессе окраски по способу Грама приобретающие

"грамоотрицательность". Без учета морфологии и расположения кокков

в данном случае легко может быть допущена лабораторная ошибка -

они могут быть приняты за гонококки.

Для идентификации гонококков, определения чувствительности к

антибиотикам и продуцирования бета-лактамазы их выделяют в чистой

культуре. Для этого ежедневно делают пересев отдельно

расположенных колоний гонококка на свежую питательную среду того

же состава, и на среду с антибиотиками. Последняя позволяет

быстрее получить гонококк в чистой культуре. Субкультуры изучают

под микроскопом на наличие в них бактерий других видов. Чистая

культура гонококка не должна содержать ни единой популяции других

микроорганизмов. Иногда приходится получать субкультуры несколько

раз (3-5) для достижения чистоты. Чистую культуру гонококка можно

при необходимости сохранять в лиофильно высушенном состоянии или

на МПА из кроличьего мяса с кусочками печени под стерильным

вазелиновым маслом с пересевами 1-2 раза в месяц. Для

кратковременного сохранения гонококков нужно пересевать чистую

культуру ежедневно на свежую питательную среду.

Значительную помощь для обнаружения гонококковых колоний в

смешанных культурах оказывает реакция на цитохромную оксидазу,

которая несмотря на ее неспецифичность, является

высокочувствительным вспомогательным приемом при проведении

культуральной диагностики гонореи. Она позволяет быстро находить

единичные колонии гонококка при наличии большого числа колоний

других микроорганизмов, выросших на поверхности питательной среды.

Кроме того, с помощью реакции на оксидазу можно быстрее и точнее

определять гонококковые колонии на поверхности непрозрачных

питательных сред.

В качестве оксидазного реактива используют 1% водный раствор

диметилпарафенилендиамина, диэтилпарафенилендиаминсульфата,

парааминоэтиланилинсульфата, цветные проявители ЦП-2; Т-34, Т-32,

ЦПВ-1. Растворы реактивов готовят на дистиллированной воде или

изотоническом растворе натрия хлорида каждый раз перед

применением. После того, как выросшие в пробирках на питательной

среде культуры изучены макроскопически и подозрительные на

гонококки колонии пересеяны на свежую питательную среду для

выделения чистой культуры, из оставшихся колоний микроорганизмов

сделаны мазки в капле водопроводной воды для дальнейшего

исследования в окраске по способу Грама, на скошенную поверхность

питательной среды с ростом бактерий наслаивают раствор оксидазного

реактива пастеровской пипеткой так, чтобы он, стекая по

поверхности среды, смачивал все выросшие на ней колонии

микроорганизмов. Пробирки оставляют при комнатной температуре и

просматривают. Оксидазную реакцию считают положительной при

окрашивании хотя бы одной колонии микроорганизмов и отрицательной,

если через 10-15 мин. смоченные раствором оксидазного реактива,

колонии не окрашивались. Оксидазоположительные колонии, если

нужно, пересеивают немедленно на свежую питательную среду, а

оставшиеся колонии снимают петлей, делают из них мазки, которые

окрашивают по способу Грама и исследуют под микроскопом. Для

выделения чистой культуры гонококка лучше производить пересев

колоний, не окрашенных оксидазным реактивом, если же

дифференцировать их без оксидазной реакции не представляется

возможным, то пересевать окрашенную колонию надо в первые секунды

после начала окрашивания, так как реактив, оказывая токсическое

действие на гонококки, снижает их жизнеспособность. Пересев по

прошествии нескольких минут после воздействия реактива уже не дает

роста гонококков. Гонококковые колонии после наслоения раствора

реактива через несколько секунд окрашиваются вначале в розовый,

затем в красный, а через несколько минут - в черный цвет. Они

окрашиваются даже при наличии смешанных колоний, состоящих из

гонококков и других микроорганизмов. Колонии оксидазоотрицательных

микроорганизмов не окрашиваются, сохраняя цвет своего пигмента или

оставаясь бесцветными.

Высокая чувствительность оксидазной реакции не согласуется с

ее специфичностью. Оксидазоположительными могут быть и другие

бактерии, которые в процессе своей жизнедеятельности выделяют

цитохромную оксидазу, поэтому оксидазоположительные колонии

микроорганизмов обязательно нужно исследовать в окраске по способу

Грама.

 

Дифференциация грамотрицательных кокков

 

Большое практическое значение имеет дифференциация

грамотрицательных кокков. При обнаружении их в посевах

патологического отделяемого у больных детей необходимо выделение

чистой культуры грамотрицательных кокков и дифференциация их по

ферментативным свойствам. Подобное исследование необходимо

производить и при обнаружении в посевах у взрослых нетипичных

грамотрицательных кокков.

Важное эпидемиологическое значение имеет выявление

экстрагенитальных очагов гонореи, так как, во-первых, при

недостаточно полном обследовании больных они не определяются,

во-вторых, чувствительность гонококков к антибиотикам, в

частности, к бензилпенициллину, в этих очагах может быть

пониженной, из-за чего не наступает их санация в результате

лечения. В связи с тем, что бактериоскопия при гонорее миндалин и

глотки дает обычно отрицательный результат, первостепенное

значение приобретает бактериологическое исследование.

Ввиду наличия на слизистой оболочке миндалин и глотки большого

числа различных нейссерий, решающее значение приобретает выделение

чистых культур грамотрицательных кокков и их тщательная

идентификация путем изучения морфологических свойств, особенностей

роста на питательных средах, пигментообразования и определения

сахаролитических свойств. Наиболее трудным является

дифференцирование гонококка от менингококка. Следует учитывать

возможность получения смешанных культур гонококка с другими

нейссериями. В мазках из культур гонококк отличается от других

нейссерий меньшей интенсивностью окраски и четкостью контуров,

более выраженным лизисом и типичным расположением в виде скоплений

с густым центром и рассыпанными по периферии кокками. Это

расположение обусловлено большей слизистостью колоний гонококка.

Колонии большинства непатогенных нейссерий - непрозрачны,

гонококка и менингококка - прозрачны. Колонии гонококка мельче

колоний менингококка, последние - более плоские. При изучении

роста микроорганизмов через слой питательной среды с боковым

электрическим освещением отмечается голубой оттенок колоний