Ферменты, участвующие в метаболизме ксенобиотиков.

( Различные соединения конкурируют за места связывания с цитохромом Р₄₅₀)

Установленные закономерности функционирования микросомальных монооксигеназ получены преимущественно при исследовании печеночной ткани.

Катализируемые цитохромом Р₄₅₀ реакции обычно можно описать уравнением:

RH +О₂ + NADPH + Н⁺ R-OH + H₂0 + NADP⁺

Цитохром Р₄₅₀ называют также оксигеназой смешанного действия, поскольку он не только гидроксилирует субстрат, но и восстанавливает O₂ до Н₂0. Последовательность реакций биотрансформации липофильного ксенобиотика цитохромом Р₄₅₀ представлена на схеме 1.

 

 

. Общая схема биотрансформации химических веществ микросомальными монооксигеназами печени

Вещество, подвергающееся биотрансформации (АН), на I стадии взаимодействует с окисленной формой цитохрома Р₄₅₀ (Fe³⁺) с образованием фермент-субстратного комплекса (AH-Fe³⁺). На II стадии фермент-субстратный комплекс восстанавливается (AH-Fe²⁺) электроном, поступающим из НАДФ-Н-зависимой цепи переноса от НАДФ-Н посредством НАДФ-Н-цитохром Р₄₅₀-редуктазы при возможном участии цитохрома b_5. III стадия характеризуется взаимодействием восстановленного фермент-субстратного комплекса с кислородом (АН-Fе²⁺-О₂) Присоединение кислорода осуществляется с большой скоростью. На IV стадии тройной комплекс фермент-субстрат-кислород (AH-Fe²⁺O^2-) восстанавливается вторым электроном, который, по-видимому, поступает из НАД-Н-специфической цепи переноса, включающей НАДН-цитохром b₅ редуктазу, НАДН и, возможно, цитохром b_5. V стадия характеризуется внутримолекулярными превращениями восстановленного тройного комплекса — фермент-субстрат-кислород (AH-Fe²⁺0₂^2- AH-Fe³⁺-0₂^2-) и его распадом с освобождением воды и гидроксилированного субстрата. При этом цитохром Р₄₅₀ переходит в исходную форму, готовую к взаимодействию со следующей молекулой субстрата. Лимитирующей стадией этого процесса является превращение тройного комплекса после его восстановления вторым электроном.

Первый электрон, поступающий из НАДФН-зависимой цепи, участвует в восстановлении Fe³⁺ (вторая стадия). Второй электрон поступает из НАДН·Н⁺-зависимой цепи и расходуется на образование активированного комплекса в четвертой стадии процесса гидроксилирования.

5. Сформулируйте, в чем заключается роль глутатиона в метаболизме ксенобиотиков. Ответ Наиболее широка и многообразна активность семейства глутатионтрансфераз, метаболизируюших тысячи ксенобиотиков. Большинство этих ферментов находится в цитоплазме, но некоторые из них локализованы в мембранах ЭПС и митохондрий. Основная реакция - конъюгация с восстановленным глутатионом – γ-глутамилцистеинил-глицином (G-SH) - протекает в двух вариантах: 1) присоединение к субстрату (алкены и эпоксиды) полной молекулы G-SH, 2) нуклеофильное замещение по электрофильным атомам углерода (галоген- и нитроалканы), азота (тринитроглицерин), серы (тиоцианаты и дисульфиды) или фосфора (метилпаратион).

При дальнейшем метаболизме глутатионовые конъюгаты переходят в меркаптуровые кислоты или меркаптаны. Кроме того, глутатионтрансферазы восстанавливают органические гидроперекиси в спирты и изомеризуют некоторые стероиды и простагландины.

 

6. В чем проявляется взаимосвязь биотрансформации ксенобиотиков и активации свободно-радикальных процессов? Ответ: В зависимости от условий реакции цитохром Р₄₅₀ может функционировать в микросомах как одно-, двух- и четырёхэлектронная оксидаза, прямо генерируя О_2ׁ^ˉ, Н₂О₂ и Н₂О в активном центре фермента. Активные формы кислорода могут образовываться в результате разобщения микросомальных моноокисгеназных реакций. При этом часть активных молекул кислорода не вступают в реакцию с субстратом, а высвобождаются из восстановленных комплексов цитохрома Р₄₅₀.

Существование в клетке оксидазных и оксигеназных систем, генерирующих активные формы кислорода позволило предположить, что кислородные радикалы играют регулирующую роль в распаде белка. В связи с этим, цитохром Р₄₅₀-зависимая монооксигеназная система также может быть вовлечена в окислительную инактивацию внутриклеточных ферментов. В тоже время цитохром Р₄₅₀, генерируя активные формы кислорода в каталитическом цикле, может действовать и как «фермент-самоубийца». Важно отметить, что ранее существующее мнение о неспецифичности окислительной модификации ферментных белков в процессе катализа в настоящее время подвергнуто сомнению. Так в работах А.И. Арчакова с соавт. (1995) показано, что инактивация цитохрома Р₄₅₀ носит селективный характер. Модифицируется лишь тот фермент, на котором образуются активные формы кислорода. Механизм разрушения цитохрома Р₄₅₀ перекисью водорода, по-видимому, включает образование гидроксильных радикалов в реакции Фентона, которые могут окислять гем и модифицировать некоторые аминокислоты вблизи каталитического центра, что позволяет эндогенным протеазам узнать модифицированный фермент и подвергнуть его гидролитическому расщеплению. В этом случае распад белка носит не случайный характер, а направлен на удаление каталитически модифицированных молекул. В отличие от неспецифической модификации белка, наблюдаемой в системах, генерирующих активные формы кислорода, окислительная самоинактивация цитохрома Р₄₅₀ в гидроксилазных реакциях может специфически регулировать распад только работающего фермента. Возможно, что модифицированные ферменты разрушаются как посредством прямой фрагментации под действием кислородных радикалов, так и вследствие протеолиза. В то же время, генерируя активные формы кислорода, цитохром Р₄₅₀ – монооксигеназная система может участвовать в окислительной инактивации других внутриклеточных ферментов, регулируя тем самым их распад в клетке. Необходимо отметить, что эта реакция очень сходна с реакцией модификации макромолекул в NADРH – оксидазной системе фагоцитов в процессе их микробицидного действия. Причём во всех типах реакций каталитически образующаяся перекись водорода играет ведущую роль.

Таким образом, возможность самоинактивации определённых форм цитохрома Р₄₅₀ со всеми вытекающими последствиями необходимо учитывать при рассмотрении таких ситуаций, когда в организм человека поступают извне чужеродные соединения, в том числе лекарственные вещества, в повышенных количествах.

 

 

Практические навыки, которыми должен овладеть студент: уметь сформулировать принципиальное различие между митохондриальным и микросомальным окислением.

Темы реферативных сообщений по теме:

Классификация свободнорадикальных форм в организме человека и их роль в жизнедеятельности

Практические навыки, которыми должен овладеть студент – знать механизмы антирадикальной защиты организма

 

Практическое занятие № 12

(семинар)

ТЕМА: Коллоквиум по биологическому окислении и хромопротеидам

ЦЕЛИ ЗАНЯТИЯ:проверить усвояемость знаний, полученных в течение предыдущих текущих занятий

СПИСОК ОСНОВНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Лекции по курсу биологической химии

2. Северин Е.С. Биохимия. М. 2006

3. Николаев А.Я. Биологическая химия. 2004

4. Таганович А.Д. Кухта В.К Биологическая химия. 2005

5. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. М. 2001

СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Маршалл В.Дж. Клиническая биохимия, 2002

2. Марри Р. Греннер Д. Биохимия человека, 2000

3. Некоторые вопросы биохимии детского возраста. Учебное пособие для студентов педиатрического факультета, Оренбург, 2012.- 120С.

Учебная карта занятия

Содержание темы

1. Современное представление о механизме биологического окисления. Субстраты биологического окисления. Стадии (фазы) биологического окисления - этапы унификации энергетического материала
2. Ферменты биологического окисления. Классификация по химической природе, характеру действия:
1. пиридинзависимые дегидрогеназы, представители;
2. флавинзависимые дегидрогеназы, представители;
3. Тканевое дыхание – терминальный этап биологического окисления. Роль кислорода в процессе тканевого дыхания.
4. Структура дыхательных цепей (ЦТЭ). Редокс-потенциалы компонентов дыхательных цепей.
5. Окислительное фосфорилирование – главный механизм синтеза АТФ в аэробных условиях. Сопряжение процессов окисления и фосфорилирования. Представление о хемиосмотической (протондвижущей) теории Митчелла. Коэффициент фосфорилирования (Р/О)

6. Зависимость интенсивности тканевого дыхания от концентрации в клетке АДФ - дыхательный контроль.

7. Вещества, влияющие на энергетический обмен в клетках: разобщители дыхания и окислительного фосфорилирования (динитрофенолы, неэстерифицированные жирные кислоты, антибиотики).

1. Свободное, нефосфорилирующее окисление в митохондриях, его биологическое значение в процессе термогенеза (митохондрии бурого жира новорожденных).
2. Цикл Кребса (ЦТК) – общий метаболический путь, завершающий катаболизм всех видов биологического «топлива», образующего ацетил- СоА.
3. Биологическая роль ЦТК, взаимосвязь с тканевым дыханием (ЦТЭ), энергетический эффект одного оборота цикла (окисление 1 молекулы ацетил- СоА) с учетом ЦТЭ.
4. Поступление, переваривание и всасывание хромопротеидов. Особенности в детском возрасте
5. Транспорт железа, синтез порфиринов. Особенности в детстком возрасте
6. Понятие о порфириях.
7. Тканевый распад железосодержащих хромопротеидов.
8. Образование желчных пигментов, пигментов кала и мочи.
9. Патология пигментного обмена. Виды желтух.
10. Физиологическая желтуха новорожденных. Идиопатические формы желтух, их причины, клинические проявления и биохимические нарушения, возникающие при этих состояниях.
11. Сложные белки-хромопротеиды. Определение. Классификация.
12. Гемоглобин. Структура и биологическая роль. Характеристика гема и глобина.
13. Содержание гемоглобина в разные возрастные периоды.
14. Формы гемоглобина. Возрастные особенности.
15. Производные гемоглобина.
16. Миоглобин.
17. Порфирины. Биологическая роль. Патология порфиринового обмена.
18. Пероксидаза и каталаза.
19. Система цитохромов. Дыхательный фермент Варбурга - цитохромоксидаза. Цитохром С. Особенности структуры, биологическая роль.

Базисные знания

Знания, полученные на предыдущих занятиях

Студент должен уметь отвечать на поставленные на коллоквиуме вопросы, самостоятельно суметь ответить на них, при необходимости написать схемы реакций или процессов, сделать выводы, решать ситуационные задачи, тестовые задания.

Практические навыки, которыми должен овладеть студент по теме занятия

Совпадают с теми, что обозначены в 8, 9, 10, 11 занятиях

Практическое занятие № 13

(Лабораторный практикум)

ТЕМА: Сложные белки – нуклеопротеиды. Нуклеиновые кислоты.

 

ЦЕЛИ ЗАНЯТИЯ:изучить строение и обмен ДНК и РНК-протеидов. Теоретически и на практике познакомить студентов с методами биохимической оценки состояния пуринового и пиримидинового обмена

СПИСОК ОСНОВНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Лекции по курсу биологической химии

2. Северин Е.С. Биохимия. М. 2006

3. Николаев А.Я. Биологическая химия. 2004

4. Таганович А.Д. Кухта В.К Биологическая химия. 2005

5. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. М. 2001

СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Маршалл В.Дж. Клиническая биохимия, 2002

2. Марри Р. Греннер Д. Биохимия человека, 2000

3. Некоторые вопросы биохимии детского возраста. Учебное пособие для студентов педиатрического факультета, Оренбург, 2012.- 120С.

Базисные знания

Из курса биоорганической химии студенты должны знать:

Формулы следующих соединений:

а) азотистых оснований А, Г, Ц, Т, У;

б) нуклеозидов;

в) состав нуклеотидов в РНК и ДНК;

г) уметь писать ди- и тринуклеотиды;

д) знать уровни организации НК (первичную, вторичную, третичную структуры).

Студент должен уметь определять и рассчитывать содержание мочевой кислоты в крови

Учебная карта занятия

ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ

1. Строение и номенклатура основных пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.

2. Первичная структура ДНК и основных разновидностей РНК.

3. Вторичная и третичная структура ДНК и РНК.

4. Источники атомов в биосинтезе пуринового ядра.

5. Последовательность реакций в синтезе пиримидиновых нуклеотидов.

6. Химизм катаболизма нуклеиновых кислот до образования конечных

продуктов распада пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.

8. Нарушение пуринового и пиримидинового обмена. Заболевания и

связанные с этими заболеваниями нарушения в обмене нуклеотидов. Особенности обмена в деском возрасте

9.Молекулярные болезни, связанные с нарушением обмена нуклеопротеидов:

1. Нарушение метаболизма пуриновых нуклеотидов:

Первичная гиперурикемия

- Синдром Леша-Нихена (ювенильная гиперурикемия)

- Подагра

Вторичная гиперурикемии

2. Гипоурикемия

3.Нарушение обмена пиримидиновых нуклеотидов:

- Наследственная оротовая ацидурия. I и II типа.

- Синдром Рейе.

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА