Хроматографическое разделение аминокислот на бумаге

Определение содержания отдельных амнокислот методом хроматографии на бумаге важно для изучения обмена белков и аминокислот в организме. С помощью бумажной хроматографии можно легко провести разделение аминокислот, содержащихся в гидролизате различных белков, сыворотке крови, моче и т.д.

Принцип метода. Основан на том, что различные растворители (Н-бутанол; СН₃СООН; фенол, насыщенный водой и др.), смачивая хроматографическую бумагу, создают на ней две фазы: неподвижную водную фазу и подвижную фазу органического растворителя. Неподвижная водная фаза образуется в силу значительной гигроскопичности бумаги, т.е. свойства задерживать определенное количество влаги на поверхности волокон целлюлозы. Органический растворитель, двигаясь по бумаге, увлекает за собой аминокислоты, которые перемещаются с различной скоростью. Она зависит от способности аминокислот растворяться в органическом растворителе (или воде). От избирательной адсорбции, от окружающей температуры, сорта бумаги, растворителя и ряда других факторов.

Хроматографию проводят в герметических камерах, насыщенных парами растворителя.

Для проведения восходящей хроматографии на нижний конец хроматографической бумаги наносят определенный объем исследуемого раствора, высушивают, нижний край бумаги помещают в растворитель и бумагу закрепляют в этом положении. Камеру закрывают. Растворитель поднимается по бумаге и увлекает за собой аминокислоты. При этом происходит разделение аминокислот из смеси. После того, как фронт растворителя по бумаге достигнет определенного уровня, бумагу вынимают из камеры, высушивают, а аминокислоты проявляют с помощью нингидрина.

Скорость передвижения аминокислот на бумаге характеризуется коэффициентом распределения Rf. Это отношение расстояния от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна (А) к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя (Б) А

Rf.= ----

Б

Rf. является величиной, характерной для каждой аминокислоты, и постоянен при данных условиях опыта.

 

Ход работы. На конце полоски фильтровальной бумаги размером 1х15см сделать прокол иглой, продеть нитку, завязать петлю. На противоположном конце простым карандашом, отступив от края на 1 см, нанести кружок, в который наносят смесь аминокислот.

На дно пробирки, не задевая стенок, поместить 1,5 мл растворителя. Придерживая за нитку, опустить бумажку до соприкосновения ее нижнего края с ратворителем и закрыть пробирку, чтобы бумажка висела на нитке, касаясь нижним краем растворителя. Через час бумагу вынимают, просушивают, смачивают 0,5% раствором нингидрина в ацетоне, снова просушивают, и помещают в термостат на 15 минут при температуре 55С в темноте. Отмечают появление фиолетовых пятен. Проводят расчет для каждой аминокислоты.

Результат.

Вывод.

Домашнее задание

Решить ситуационные задачи и ответить на вопросы

• С целью стерилизации различных объектов их обрабатывают формальдегидом. Что происходит при этом с белками?

Ответ: в микробных патологических белках формальдегид разрушает гидрофобные и водородные связи, стабилизирующие третичную структуру белка. При этом они гибнут.

 

• Препараты, содержащие березовый деготь, обладают выраженным антимикробным действием. Предположите возможный механизм действия, исходя из того, что березовый деготь содержит в своем составе фенол.

Ответ: Фенол является гидрофобным веществом, его действие в отношении микронных белков аналогично действию формальдегида

 

• Для профилактики инфекционных заболеваний контактным лицам вводят препарат из крови рековалесцентов, содержащих антитела к данному заболеванию. Этот препарат называется гамма-глобулин. Как его получить из сыворотки крови? Как очистить от примесей?

Ответ Получают гама –глобулин либо методом фракционирования белков этиловым спиртом при низких температурах, либо высаливанием, очищение производят методами электрофореза или ионообменной хроматографии, или гель- хроматографии. Пропускают очищаемые растворы через колонку с иммуносорбентом, отмывают иммуносорбент, элюируют, а затем удаляют диисоциирующий агент с помощью диализа.

 

• Вам дали две пробирки с осажденным белком. Известно, что один осадок получен при действии сернокислого аммония, а второй – после добавления ТХУ. Как отличить их? В чем сходство и в чем отличие при действии этих агентов на белок?

Ответ В первой пробирке провели обратимое осаждение, во второй - необратимое. Поэтому в первой пробирке после добавления воды белок восстановится, осадок исчезнет. Во второй пробирке осадок после добавления воды останется.

5. Имеются пробирки с растворами: I концентрированной азотной кислоты

II 10% трихлоруксусной кислоты

III СuSO4 в10% NaOH

Опишите, какие процессы произойдут в каждой пробирке при добавлении в них раствора белка. Какие из этих реакций находят практическое применение?

1 пробирка - Азотная концентрированная кислота является денатурирующим агентом, применяется для осаждения белков, в медицине используется в реакции обнаружения белка в моче (проба Геллера). Концентрированная минеральная кислота НNO₃ вызывает денатурацию белка и образует комплексные соли белка с кислотой. На границе двух слоев жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца. В пробирку наливают 1 мл концентрированной НNO₃, наклоняют пробирку под углом 45⁰ и осторожно по стенке пипеткой наслаивают 1мл мочи.

2 пробирка - 10% трихлоруксусная кислота также денатурирующий агент, используется для осаждения белков крови, например, при определении ПВК

3 пробирка - такой раствор используется для осаждения белка при определении концентрации белка в крови, так называемый биуретовый метод

Приложения Шапероны

Функции шаперонов.

Функции, приписываемые шаперонам, весьма широки.

1)Прежде всего это, обеспечение правильного фолдинга новообразованных белков.

В данной функции есть несколько аспектов.

а) Так, до того, как большинство гидрофобных аминокислотных радикалов уйдет внутрь белковой частицы, они могут вступить во взаимодействие с аналогичными радикалами других пептидных цепей. Иначе говоря, до окончания фолдинга возможна агрегация новосинтезированных белковых молекул. Случившись же, такая агрегация и воспрепятствовала бы дальнейшему фолдингу этих молекул, и создала бы ненужный баласт в клетке.

Предупреждение агрегации новых белков, т.е. предупреждение «неправильных» внешних взаимодействий в ходе фолдинга — одна из важнейших задач шаперонов.

б) Другая сопряженная задача — предупреждение «неправильных» внутренних (в пределах одной пептидной цепи) взаимодействий.

в) Третий аспект той же функции — лабилизация «неправильных» слабых связей (если они все-таки образовались) с тем, чтобы пептидная цепь не оказывалась зафиксирована в «неправильной» конформации, а могла достичь наиболее оптимальной. Очевидно, здесь — прямое сходство с функциям обеих фолдаз, но только речь идет о лабилизации не ковалентных, а слабых связей.

Все вместе это и означает «обеспечение правильного фолдинга». Говоря это, под фолдингом понимают не только сворачивание пептидной цепи, но и (в случае олигомерных белков) свя­зывание друг с другом субъединиц в четвертичную структуру.

2) Следующая функция шаперонов — контроль за рефолдингом. Имеется в виду, что под действием самых разных причин (перегрева, облучения, действия оксидантов и т. д.) белки, относительно давно синтезированные и до того успешно функционировавшие, могут терять свою нативную конформацию. Иначе говоря, частично или полностью денатурировать, что, как мы уже отмечали, сопровождается склонностью к агрегации.

Так вот, видимо, такие белки в клетке могут подвергаться рефолдингу (или ренатурации)— при активной помощи шаперонов.

Причем синтез шаперонов значительно возрастает, если клетка относительно долго пребывает в стрессовых условиях. Это показано, в частности, для бактерий (Е.coli): инкубация их (температуре 42°С приводит к резкому увеличению т. н. белков теплового шока, которые являются ничем иным как шаперонами.

Аналогичный эффект наблюдается и у эукариот. Поэтому у тех и у других шапероны часто обозначаются буквами Hsp (от английского: heat

shock proteins — белки теплового шока).

Что нужно для обеспечения этими белками рефолдинга?— практически то же, что и для обеспечения фолдинга: предупреждение агрегации и лабилизация связей пространственной структуры. Тогда пептидная цепь получит возможность вновь найти нативную (и энергетически наиболее выгодную) конформацию.

3) Третья функция шаперонов—участие в некоторых видах внутриклеточного транспорта белков: в частности, в лизосомы (для белков, «отслуживших» свой срок и не поддающихся рефолдингу) и в митохондрии.Чем вызвано участие шаперонов в переносе «старых» белков в лизосомы? Очевидно, опять-таки необходимостью предупредить агрегацию.

В митохондрии переносятся, напротив, новосинтезированные белки, за счет собственной активности митохондрий синтезируется только 5% их белков; остальные белки поступают из цитозоля, где образуется на видных рибосомах.

Фолдинг же этих остальных (95 %) белков откладывается до момента, пока они не окажутся внутри митохондрий.

Это объясняется тем, что пептидной цепи гораздо легче проникнуть через липидные слои мембран (а у митохондрий мембран целых две), если она находится в развернутом состоянии и гидрофобные радикалы не спрятаны внутрь частицы.

Что же делают шапероны? — Те из них, которые находятся вне митохондрий, сразу связываются с продуктами трансляции поддерживают их в развернутом состоянии (в состоянии пребелков) до контакта с митохондриальными мембранами. Иначе говоря, эти шапероны предупреждают преждевременный рефолдинг.

Другие же шапероны (находящиеся внутри митохондрий) принимают «гостей» и помогают им принять нативную форму.

4)Четвертая функция — поддержание ряда белков в oпределенной конформации, в состоянии как бы незавершенного фолдинга. В этом случае, очевидно, шапероны не теряют связи с соответствующим белком после его сворачивания.

Примером может служить локализующийся в цитоплазме белковый рецептор к гликокортикоидным гормонам. В отсутствие этих гормонов он связан с комплексом шаперонов (Hsp- белков теплового шока). В таком состоянии у рецептора закрыта (экранирована) т. н. ядерная метка — та часть пептидной цепи, которая необходима для проникновения белка внутрь ядра.

После же связывания гликокортикоидов белки Hsp, диссоциируют, фолдинг завершается и ядерная метка оказывается на поверхности. Поэтому рецептор проникает в ядро, переходит в димерную форму и связывается с определенным участком ДНК.

Второй пример — содержащиеся в ядре рецепторы к другим стероидным гормонам — эстрогенам и прогестерону. Эти белки тоже связаны с шаперонами (Hsp). Но теперь незавершенность фолдинга приводит не к блокированию ядерной мембраны (комплекс, как сказано, находится в ядре), а к неспособности связываться с ДНК.

Опять-таки, присоединение соответствующего гормона вызывает диссоциацию шаперонов, изменение структуры рецептора и связывание последнего с нужным локусом ДНК.

Как же выполняют шапероны все эти многочисленные функции? Надо думать, механизмы действия шаперонов различны — как разнообразны, вероятно, и сами шапероны.

Рассмотрим некоторые наиболее изученные системы, ответственные за выполнение, по крайней мере, двух первых вышеперечисленных функций, т. е. за фолдинг новообразованных и рефолдинг поврежденных белков.

 

Прионы как антишапероны

Из предыдущего изложения можно представить, что фолдинг— особенно с участием фолдаз и шаперонов — всегда приводит полипептидную цепь к «правильной», наиболее оптимальной в энергетическом и функциональном отношениях. К сожалению, это не так. Существует группа тяжелых неврологических болезней, которые обусловлены закономерно повторяющимся «неправильным» фолдингом одного, вполне определенного белка.

Данный белок, если он находится в нормальной конформации, называется прионовым белком и обозначается буква РгР^с (от prion protein, constitutive). Обнаруживается он в мозгу функция его неизвестна.

При ряде же заболеваний тот же полипептид оказывается в другой конформации. В последней преобладают участки с β-структурой, почти отсутствующие в нативной форме, а молекулы белка имеют повышенную склонность к агрегации. Такой белок называется прионом (от proteinaceous infection particle-белковая инфекционная частица) и обозначается буквами РгP^sc В данной форме он, видимо, не способен к выполнению обычной функции.

Но самое худшее заключается в том, что «неправильная» форма белка вызывает переход в такую же форму и «правильных» форм.

Как это происходит, неясно. Возможно, имеет место захват «правильных» молекул агрегатами приона, в результате чего эти молекулы разворачиваются и организуются заново по подобию прионов.

Таким образом, прионы в отношении своих исходных молекул играют роль антишаперонов, осуществляющих как бы фолдинг наоборот. Более того, процесс, очевидно, является автока-талитическим: вновь образовавшиеся порции «испорченного» белка начинают «портить» очередные порции нативного белка — и так далее, пока весь белок не оказывается «испорченным». Процесс происходит относительно медленно — болезнь развивается в течение нескольких лет, но неотвратимо приводит к гибели животного или человека.

Как возникают в организме первые порции приона?

а) Иногда, чрезвычайно редко, это происходит спонтанно — в результате ошибки фолдинга.

б) Несколько чаще встречаются мутации гена РгР —такие, которые способствуют неправильному сворачиванию белка. Тогда болезнь передается по наследству.

в) Но наиболее часто болезнь возникает в результате потребления в пищу тех тканей животного, в которых содержатся прионы. Потому-то данные белки и названы инфекционными частицами. Их отличает еще одна очень важная особенность — устойчивость к протеазам. Именно благодаря ей отдельным молекулам прионов удается проникать в неизмененном виде из желудочно-кишечного тракта в нервную ткань, где и запускается вышеизложенный автокаталитический процесс.

Все вместе это делает прионы уникальным инфекционным агентом:это, видимо, единственный случай, когда подобный агент лишен нуклеиновой кислоты.

Как же называются вызываемые прионами болезни?

У коров это т.н. губчатая энцефалопатия (BSE — bovine spongiform encephalopathy), или коровье бешенство.

Потребление человеком мяса таких коров вызывает болезнь Крейнцфельда-Якоба. Кроме того, среди туземцев Новой Гвинеи известна еще одна болезнь той же природы — куру, при которой на лице человека и дело появляются гримасы, как при смехе. Считают, что передается в результате каннибализма.

Наконец, у овец болезнь называется почесухой:постоянный зуд заставляет животных все время тереться о твердые предметы. Таким образом, фолдинг — важный этап в образовании белков.

Практические навыки, которыми должен овладеть студент по теме занятия

Знать методы выделения индивидуальных белков: гель-фильтрацию, ионообменную, афинную хроматографию.

 

Решить тестовые задания

Выберите правильный ответ.

Под изменением конформации понимают:

1 – изменение аминокислотной последовательности полипептидной цепи

2 – изменение вторичной и третичной структуры полипептидной цепи

3 – замену одной простетической группы в сложном белке на другую

4– изменение взаиморасположения в пространстве субъединиц олигомерного белка

Ответ 2. объясняется это нарушением связей между аминокислотными остатками

Выберите правильный ответ.

Функциональное многообразие природных белков обеспечивается различиями:

1 – аминокислотного состава

2 – длиной полипептидной цепи

3 – молекулярной массы

4 – чередованием аминокислот в полипептидной цепи

Ответ 1. Некоторые белки или пептиды имеют различия в аминокислотном составе всего по одной-двум аминокислотам, но такие замены полностью изменяют физико-химические, а в итоге - биологические свойства белка

Выберите правильный ответ.

Денатурация белка – это

1- разрыв ковалентных связей в полипептидной цепи

2- нарушение вторичной структуры белка за счет разрыва водородных связей

3- нарушение нативной пространственной конформации белка за счет негидролитического разрыва нековалентных связей

Ответ 3- исходя из определения, что денатурация- это любое негидролитическое разрушение третичной структуры белковой молекулы, причем, чаще всего разрыву подвергаются нековалентные связи

4. Выберите правильные ответы.

Денатурация белка сопровождается:

1. - разрушением большого числа межрадикальных связей

2. - уменьшением растворимости белка

3. - нарушением пространственной структуры (нативной конформации)

4. - изменением первичной структуры

Ответы 1, 2, 3 – см. предыдущий ответ, но требуется добавить, что при нарушении структуры белка (пространственная структура нарушается) обнажаются гидрофобные радикалы, что влечет за собой потерю гидратной оболчки, а следовательно- снижение растворимости

5. Оцените правильность утверждения:

При высаливании белок выпадает в осадок, потому что нарушается конформация белковой молекулы

1. да

2. нет

Ответ 2, так как при высаливании теряется гидратная оболочка, при этом конформация сохраняется, поэтому высаливание относят к обратимому осаждению

6.Выберите правильные ответы.

При высаливании белков из растворов происходит:

1 - уменьшение растворимости белка

2 – обратимое осаждение

3 – необратимое осаждение

4 – сохранение нативной конформации

5 – временная потеря биологических свойств

Ответ 1, 2, 4, 5 см предыдущий ответ, разбавление растворов водой приводит к восстановлению гидратной оболочки и восстановлению биологических свойств.

7. Выберите правильные ответы.

При денатурации белков происходит:

1 - уменьшение растворимости белка

2 – обратимое осаждение

3 – необратимое осаждение

4 – сохранение нативной конформации

5 – потеря биологических свойств

Ответы 1, 3, 5

8. Выберите правильные ответы.

Факторы, вызывающие денатурацию:

1. Температура выше 60-70С

2. Насыщенный раствор (NH₄ )₂SO₄

3. Ионизирующее излучение

4. Сдавление, вибрация

5. Токсины, яды

Ответы 1,3,4,5

Практические навыки, которыми должен овладеть студент по теме занятия

Должен освоить методы качественного обнаружения белков в биологических жидкостях, уметь интерпретировать лабораторные данные.

 

Практическое занятие №3

ТЕМА: Ферменты. строение. Общие свойства ферментов

ЦЕЛИ ЗАНЯТИЯ:

1.Знать химическую природу, строение, свойства простых и сложных ферментов.

2. Знать принципы качественного определения активности ферментов в биологических жидкостях, тканях или их экстрактах и научиться методам обнаружения в слюне фермента a-амилазы.

1. Исследовать зависимость ферментативной активности от t и pН среды на примере реакции, катализируемой -амилазой.

2. Уметь анализировать полученные результаты, сделать правильное заключение об оpt t и pН среды для работы фермента и уметь объяснить причины различной активности - амилазы в условиях разного t режима и pН среды.

Иметь представление о возможности использования знаний о свойствах ферментов в медицинской практике.

 

СПИСОК ОСНОВНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Лекции по курсу биологической химии

2. Северин Е.С. Биохимия. М. 2006

3. Николаев А.Я. Биологическая химия. 2004

4. Таганович А.Д. Кухта В.К Биологическая химия. 2005

5. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. М. 2001

СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

6. Маршалл В.Дж. Клиническая биохимия, 2002

7. Марри Р. Греннер Д. Биохимия человека, 2000

8. Некоторые вопросы биохимии детского возраста. Учебное пособие для студентов педиатрического факультета, Оренбург, 2012.- 120С.

Учебная карта занятия

Базисные знания

• Из курса биоорганической химии студенты должны знать: простые и сложные белки;

• сведения о витаминах;

• понятие о ферментах;

• свойства неорганических и органических катализаторов;

• принципы качественного обнаружения активности ферментов.

Студент должен уметь усвоить принципы качественного определения ферментов

Содержание темы

1. Химическая природа ферментов. Проферменты (зимогены).

2. Кофакторы ферментов: химическая природа, классификация, роль витаминов в построении кофакторов и их коферментная функция.

3. Коферменты и простетические группы.

4. Структурно-функциональная организация ферментных белков: активный центр, его свойства. Контактный и каталитический участки активного центра ферментов.

5. Регуляторные (аллостерические) центры ферментов. Аллостерические модуляторы ферментов. Зависимость активности ферментов от конформации белков.

6. Представление об активаторах и ингибиторах ферментов. Биологическое и медицинское значение активаторов и ингибиторов ферментов.

7. Общие свойства ферментов. Зависимость активности ферментов от реакции среды и температуры: биологическое и медицинское значение этих свойств ферментов.

8. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата и фермента.

9. Общие принципы механизма действия ферментов.

10. Принципы качественного и количественного определения активности ферментов.

11. Номенклатура и классификация ферментов.

12. Представление об энзимотерапии и энзимодиагностики.

13. Понятие о сигнальных ферментах

14. Лактатдегирогеназа, характеристика изоферментов, свойства, особенности строения и локализации, клинико-диагностическое значение определения при заболеваниях сердца, печени и др.

15. Трансаминазы, виды, характеристика, локализация, клинико-диагностическое значение определения трансаминаз

16. Значение определения ферментов с целью прогноза и лечения.

17. Заместительные ферменты.

18. Особенности ферментного состава у детей

 

 

Практическая часть