Биосинтез нуклеиновых кислот.

 

Передача генетической информации (постулат молекулярной биологии): ДНК РНК белок. Механизм удвоения ДНК - репликация (перед делением накапливаются нуклеотиды - строительные кирпичи). В гипотезе Уотсона и Крика (1953г, трехмерная структура ДНК) самым существенным, с точки зрения генетики, является постулат, согласно которому 2 цепи ДНК комплементарны, и репликация каждой цепи, в результате которой образуются комплементарные дочерние цепи, приводит к возникновению 2 дочерних двуцепочных молекул ДНК, идентичных родительской молекуле, причем в каждой из дочерних молекул содержится одна цепь родительской. Такая репликация получила название полуконсервативной. Однако в принципе возможны и ещё 2 механизма репликации:

Меселсон и Сталь 1957/8 гг. провели эксперименты по определению способа репликации:

а) выращивали E.coli на среде (несколько поколений), содержащей в качестве источника азота (NH4Cl) изотоп N15

 

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК.

 

А.Корнберг (с 1955г - поиск фермента, синтезирующего ДНК) - ДНК-полимераза I, 500 мг чистого фермента получены из 100 кг E.coli. Условия работы фермента: все нуклеотиды, затравка ДНК, матричная ДНК. Катализ идет в напралении 5`- 3`, обладает также нуклеазной активностью. Синтез ДНК in vitro. Высокая репаративная активность.

1967 год ознаменовался открытием ДНК-лигазы - образование фосфоэфирной связи между 2 цепями. Фермент активен при наличии свободной OH-группы на 3`-конце одной цепи и фосфатной группы на 5`-конце другой, необходима затрата АТФ. Цепи ДНК, соединяемые ДНК-лигазой, должны быть двухцепочными.

В 1969 г. Лусия и Кэрнс выделили мутантную форму E.coli, где только 0,5-1% нормальной полимерной активной ДНК-п-I, размножение хорошее, но быстрая гибель при УФ-облучении (вывод - репарация ДНК нарушена в мутантной форме. Выделены ДНК-п-II, III.

Синтез новой ДНК осуществляется одновременным раскручиванием родительской ДНК. Участок ДНК при этом называется репликационной волной. Начинается в определенном месте, идет в обоих направлениях с примерно одинаковой скоростью.

Одна цепь (дочерняя) синтезируется непрерывно (ведущая), а вторая прерывисто в виде коротких фрагментов (отстающая цепь) Оказаки (до 1000 нуклеотидов), сшивают фрагменты ДНК-лигазой. Образуются несколько репликационных включений через 3-7 тыс. пар нуклеотидов.

Затравкой для синтеза ДНК служит РНК. Фермент РНК-полимераза (праймаза) синтезирует короткую цепь из 10 нуклеотидов РНК, для этого фермента не нужна затравка для синтеза полинуклеотида. Синтез ДНК можно ингибировать рифамицином (ингибитор биосинтеза РНК).

В процессе репликации участвует большое количество белков (не менее 15), которые участвуют в поиске начала репликации, сплетении, расплетении, стабилизации одноцепочных участков, инициировании работы РНК-полимеразы. Механизм репликации столь сложен, чтобы избежать ошибки, постоянно идут возвраты правильности включения нуклеотидов, редактированию (частота ошибок не более 1 на 109-1010 пар.

 

РЕПАРАЦИЯ ДНК.

 

Основания могут теряться, изменяться, разрывы внутрицепочные, поперечные сшивки (ионизирующая радиация, УФО, химические вещества). Многие повреждения можно исправить, так как есть двойная информация (2 спирали). Участвуют или ДНК-п-I или эндонкклеаза, ДНК-п-I и ДНК-лигаза. Пример: образование пиримидинового димера (тимидиновый) при действии на ДНК УФО. Сочетание Т-Т в одной цепи образует сшивку:

Золотистая ксеродерма - заболевание кожи у людей (чувствительность кожи к солнечному свету и УФО). Кожа становится сухой, дерма атрофируется, веки - рубцы, поражения роговицы, во многих местах - рак кожи (гибель до 30 лет). Причина - низкая активность эндонуклеазы, которая гидролизует остов ДНК вблизи пиримидиновых димеров.

 

ТРАНСКРИПЦИЯ.

 

Для этого процесса необходимы условия:

1. Матрица (предпочтительно 2-х цепочная ДНК).

2. Активированные предшественник(рибонуклеотидтрифосфаты).

3. Ионы металлов (Mg2+, Mn2+).

4. РНК-полимераза ММ ~500 кД, 4 субъединицы (голофермент)

a2, b, b`, d. Без d-субъединицы - минимальный фермент (кор-фермент). b` - участвует в связывании матрицы; b - участвует в связывании субстратов (нуклеотидов); d - выбор участка инициации.

 

Транскрипция начинается на определенных участках (обычно с первой цепи ДНК списывается информация) ДНК-промоторах.

1 этап - инициация (голофермент - поиск промотора).

2 этап - элонгация (функция кор-фермента).

3 этап - терминация.

 

Участвуют белки в стадиях инициации (белок F) и терминации (белок Р). РНК-п в отличие от ДНК-п не проверяет правильность новообразования РНК, отсюда надежность ниже, ошибки на 104-105 пар нуклеотидов.

Ферменты РНК-полимеразы I, II, III участвуют в образовании р-РНК, и-РНК, т-РНК; причем активные молекулы РНК образуются транскрипции (процессинг) путем расщепления и модификации новосинтезированных цепей РНК. Разграничивающие участки (спейсерные) вырезаются м-РНК - практически не изменяется (у прокариот). У эукариот м-РНК образуется из большого транскрипта и последующего сращивания (сплайсинга) фрагментов.

У онко-вирусов открыт фермент РНК-зав-ДНК-полимераза (обратная транскриптаза) - при активации идет синтез вирусной ДНК -->вирусные белки.