Методика постановки головного досліду рнга.

Реакцію можна провести в пробірках або плексигласових плашках на 72 або 96 лунок. В останньому випадку досягається економія реактивів (в лунки заливається значно менша кількість кожного реактиву, ніж в пробірки). Методика постановки досліду в плашках на 72 лунки., тобто – послідовність внесення реагентів представлено в таблиці 10.2.

 

Табл.10.2 Методика постановки реакції непрямої гемаглютинації

Компонент реакції

№1

№2

№3

№4

№5

№6

№7

№8

Фізрозчин

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

Сироватка

0,2 мл

Після змішування 2-х компонентів по 0,2 мл суміші з попередньої пробірки переноситься в наступну

Розведення (двократні)

1:10

1:20

1:40

1:80

1:160

1:320

1:640

1:1280

Ерітроцити з вірусом

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

0,2 мл

Суміш витримується 2-3 год. При 20 ^оС для взаємодії компонентів реакції

Результат

+++

+++

+++

+++

++

+

-

-

Останнє розведення, яке ще дає можливість зв’язуватись антигену (вірус на еритроцитах) з антитілом (сироватка) в кількості 50% приймається за титр антитіл. В даному випадку, титр антитіл 1:160. Вищезазначена схема дає можливість визначити кількість антитіл у вакцинованих тварин або тварин, приховано хворих.

Для перевірки якості РНГА потрібно одночасно із розкапуванням компонентів реакції поставити контролі різних типів (табл.10.3).

 

Таблиця 10.3 Контролі реакції непрямої гемаглютинації.

 

№ п/п	Компоненти, що змішуються	Необхідність контролю
	Сенсибілізовані еритроцити з фізіологічним розчином	Перевіряється можливість спонтанної аглютинації діагностикуму
	Досліджувана сироватка, до якої додаються еритроцити без вірусів.	Перевіряється можливість присутності в сироватках неспецифічних аглютинінів
	Сенсибілізовані еритроцити, до яких додається позитивна фабрична сироватка (містить антитіла саме до даного збудника).	Контролюється вигляд осаду, який повинен утворитись в реакції
	Сенсибілізовані еритроцити, до яких додається негативна фабрична сироватка (містить антитіла до збудника іншої хвороби)	Осад не повинен утворюватись.

 

Дану реакцію можна провести і в тому випадку, коли на еритроцитах адсорбовано такі білки, як антитіла. Тоді еритроцитарний діагностикум може утворити комплекс з вірусними антигенами, отриманими з патологічного матеріалу. Реакцію можна використовувати для ідентифікації вірусу та індикації вірусу після розвитку збудника в культурах клітин та курячих ембріонах.

Методика постановки реакції затримки гемаглютинації (РЗГА)

Одною з обов’язкових умов РЗГА є те, що до сироватки додають вірусну суспензію з певною концентрацією (титром) активних вірусів. Реакцію проводили за загальноприйнятими методиками у плексигласових панелях за схемою, представленою в таблиці 10.4.

 

Табл.10.4. Методика постановки РЗГА. Визначення титру вірусу в РГА і перевірка робочої дози вірусу 4 ГАО

Компонент, Мл	номер лунки
розбавлення вірусу
ряд Ф: РГА	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256	1/512	1/1024	Кер
фізрозчин	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
вірусовмісний матеріал	0,2	послідовне перенесення по 0,2 мл до десятої лунки, з десятої лунки – в дезрозчин
1%-ві еритроцити	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
експозиція 20-40 хвилин за кімнатної температури
результат	+++	+++	+++	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
ряд В: контроль ГАО вірусу	2 ГАО	1 ГАО	0,5 ГАО	0,25 ГАО
фізрозчин	0,2	0,2	0,2	0,2
вірусовмісний матеріал, Т=4 ГАО	0,2	послідовне перенесення по 0,2 мл
експозиція 20-40 хвилин за кімнатної температури
Результат	+++	++	+	-

 

В лунки вносять по 0,2 мл фізіологічного розчину, далі – 0,2 мл вірусовмісного матеріалу в першу лунку. Шляхом послідовного переносу вірусовмісного матеріалу у наступні лунки готують дворазові розбавлення вірусу (від 1:2 до 1:1024). В усі лунки додають по 0,2 мл 1% суспензії еритроцитів, панелі струшують. Після 20-30 – хвилинної експозиції за кімнатної температури враховують результат. Якщо вірус зовсім не аглютинує еритроцити (реакція негативна –), вони осідають на дні лунки у вигляді „гудзика”. Якщо вірус аглютинує 100% доданих еритроцитів, в лунках утворюється „парасолька” (реакція позитивна, оцінюється трьома плюсами, +++). За аглютинації вірусом 50% еритроцитів у лунках утворюється „парасолька” з „гудзиком” (реакція на два плюси, ++). Це відповідає 1 ЕД₅₀, яку у реакції гемаглютинації приймають за 1 ГАО.

На другому етапі перевіряють правильність робочої дози вірусу (рис. 10.3). Якщо після 20-30 хвилин експозиції результат оцінюється у першій і другій лунках не менш як на два плюси, а далі гемаглютинації не відбувається, це означає, що виготовлене розведення вірусу справді дорівнює 4 ГАО.

 

 

Рис. 10.3 Перевірка робочої дози вірусу при постановці РЗГА

 

 

На третьому етапі визначають титр АТ в сироватках крові тварин за схемою реакції затримки гемаглютинації. Після постановки реакції та 30-40- хвилинної експозиції панелей, вірус, не зв’язаний з антитілами сироватки, аглютинує еритроцити, утворюючи „парасольки”. Вірус, зв’язаний з антитілами, нездатний до аглютинації еритроцитів і вони осідають у центрі лунки („гудзик”). Отримані значення титрів антитіл порівнюють із діагностичними, після чого роблять висновок про активність досліджуваного вірусу в організмах тварин, у яких було відібрано кров.

ЗАВДАННЯ

1. Поясніть, активність яких вірусів можна визначити в одиницях ГАО. Вкажіть види та кількість лабораторного обладнання, методи його підготовки для проведення титрування вірусовмісного патологічного матеріалу в одиницях ГАО.

 

2. Дайте визначення різним одиницям, що використовуються для виміру активності вірусу (БУО, ВУО, ГАО, ЕД₅₀). Поясніть, в яких випадках використовують ту чи іншу одиницю.

 

3. Схема постановки РНГА у випадку взяття крові у дослідних тварин (ретроспективна діагностика).

 

4. Схема постановки РЗГА у випадку взяття крові у дослідних тварин (ретроспективна діагностика).

 

5. Схема постановки РНГА у випадку роботи з патологічним матеріалом або зараженою вірусом культурою клітин (серологічна ідентифікація).

 

6. Схема постановки РЗГА у випадку роботи з патологічним матеріалом або зараженою вірусом культурою клітин (серологічна ідентифікація).

 

7. Визначення робочої дози вірусу в РЗГА.

 

8. Можливі помилки при постановці РНГА.

 

9. Можливі помилки при постановці РЗГА.

 

10. Можливі помилки при титруванні вірусовмісного матеріалу на першому етапі РЗГА.

 

 

ЛІТЕРАТУРА

1. Ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. – М.: Агропромиздат, 1991. – 431 с.

2. Калініна О.С., Панікар І.І., Скибіцький В.Г. Ветеринарна вірусологія: Підручник. – К.: Вища освіта, 2004. – 432 с.

3. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. – М.: Агропромиздат, 1991. – 528 с.

4. Старке Г. Практическая вирусология. Пер. с немецкого. – М.: Колос, 1970. – 352 с.

5. Кипайкин К.А. Дезинфектология. – Ростов н/Д: Фенікс, 2003 – 448 с.

6. Практикум з ветеринарної вірусології / В.Г. Скибіцький, І.І. Панікар, О.А. Ткаченко та ін. – К.: Вища освіта, 2008. – 208 с.

7. Сергеев В.А., Собко Ю.А. Культуры клеток в ветеринарии и биотехнологии. – К.: Урожай, 1990. – 151 с.

8. Собко А.И., Сюсюкин А.А. Справочник. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных – М.: Агропромиздат, 1986.-320 с.

9. Антонов Б.И., Борисова В.В., Волкова П.М. Справочник. Лабораторные исследования в ветеринарии. – М.: Агропромиздат, 1986. – 361 с.

10. Гигиена рук в здравоохранении: Пер с нем.: Производственное издание / Под ред Г.Кампфа. – К.: Здоров'я, 2005. – 304 с.