Одиниця буо або вуо – це доза вірусовмісного матеріалу в мл, яка викликає утворення одної віспини або бляшки.

Для розрахунків (в залежності від кількості пошкоджень в ембріоні або у флаконі з культурою клітин) використовуються такі формули:

а) в випадку 50 пошкоджень на флакон або ембріон, тобто – для малоактивних вірусовмісних суспензій –

Т_в = n / V • а

де n – кількість пошкоджень (середнє арифметичне) на один флакон або курячий ембріон, V – об’єм вірусовмісного матеріалу, використаного для зараження (мл), а – використане розведення вірусовмісного матеріалу;

 

б) при наявності високоактивних вірусовмісних матеріалів, готують декілька 10-кратних розведень вихідної суспензії (1:10; 1:100; 1:1000). Кожним розведенням в 3-5 повторностях заражають ембріони або флакони з культурою клітин. Тоді розрахунки проводять по формулі:

Т_в = (n₁ + n₂+ n₃ +…+n _n) / V • (а₁ + а₂ + а₃ +… +а _n)

де n₁, n₂, n₃, n _n – кількість пошкоджень (середнє арифметичне для кожного розведення) на один флакон або курячий ембріон, V – об’єм вірусовмісного матеріалу, використаного для зараження (мл), а₁,а_2;,а₃,а _n – використані розведення вірусовмісного матеріалу, записані у вигляді 0,1 або 0,01 і т.п.

ЗАВДАННЯ

 

1. Поясніть, активність яких вірусів можна визначити в одиницях ВУО. Вкажіть види та кількість лабораторного обладнання, методи його підготовки для проведення титрування вірусовмісного патологічного матеріалу в одиницях ВУО

 

2. Поясніть, активність яких вірусів можна визначити в одиницях БУО. Вкажіть види та кількість лабораторного обладнання, методи його підготовки для проведення титрування вірусовмісного патологічного матеріалу в одиницях БУО.

 

3. До 1мл вихідної вірусовмісної суспензії додали 9 мл розчину Хенкса. По 1мл розведення внесли в 5 матрасів з культурою клітин. Після інкубації підрахували кількість бляшок в кожному матрасі.

Результати: №1 – 30шт., №2 – 35 шт., №3 – 12 шт., №4 – 28 шт., №5 – 32 шт. Необхідно визначити активність вірусу у вихідній суспензії. в одиницях локальних пошкоджень.

 

4. Вкажіть всі можливі помилки лаборанта при проведенні титрування вірусовмісного патматеріалу в гемаглютинуючих одиницях. Поясніть, до яких наслідків може призвести кожна помилка.

 

5. Внесіть в таблицю експериментальні дані про використані матеріали для визначення титру вірусу. На основі даних таблиці визначте кількість матеріалів, які необхідно знезаразити після проведення досліду.

 

Показники	Культура.клітин гр.№1	Культура.клітин гр.№2	Культура.клітин гр.№3
Конт.1	Конт.2	конт.1	конт.2	конт.1	Конт.2
К-ть вірусовмісної суспензії	Для виготовлення першого з трьох розведеннь було використано 1 мл суспензії патматеріалу
К-ть фізрозчину	Для першого з трьох розведеннь використано 9 мл фізрозчину.
Розведення п/ м.
К-ть розведеної суспензії на 1 матрас	1 мл	1мл	1мл	1мл	1мл	1мл
Використано в кожній серії досліду

 

6. 4,5 мл одержаної з патматеріалу вірусовмісної суспензии було використано для виготовлення першого розведення і визначення титру вірусу по методу 50-% інфекційної дії. Назвіть кількість і види об’єктів, які необхідно буде знезаразити після визначення титру.

7. Порівняльна характеристика методів визначення активності вірусного патологічного матеріалу. (Які з методів вимагають мінімальних та максимальних затрат, їх переваги та обмеження).

 

8. Поясніть, активність яких вірусів можна визначити в одиницях ВУО. Вкажіть види та кількість лабораторного обладнання, методи його підготовки для проведення титрування вірусовмісного патологічного матеріалу в одиницях ВУО

 

9. Поясніть, активність яких вірусів можна визначити в одиницях БУО. Вкажіть види та кількість лабораторного обладнання, методи його підготовки для проведення титрування вірусовмісного патологічного матеріалу в одиницях БУО.

 

10. Вкажіть, в яких методах визначення титру вірусів, для чого і яким шляхом використовуються живі тест-об’єкти.

 

ЗАНЯТТЯ №10

МЕтодики постановки реакції гемаглютинації

 

Використання реакції гемаглютинації у вірусології.

Реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) та непрямої гемаглютинації (РНГА).

Використання реакції гемаглютинації у вірусології

Віруси – це антигени. В зараженому організмі у відповідь на їх появу утворюються специфічні білки, які мають назву антитіла (імуноглобуліни). Антитіла реагують із підходящим (комплементарним) антигеном, нейтралізують його, не даючи йому можливості реагувати з речовинами клітин макроорганізму.

Певна кількість вірусів, таких як збудники грипу, парагрипу, кіру, аденовірусних інфекцій, інфекційного рінотрахеїту, ньюкаслської хвороби тощо здатні проникати в кров і взаємодіяти там з еритроцитами (рис.10.1).

 

Проникнення вірусу в кров

Рецептори віріонів (білки капсиду або пепломери) приєднуються до мембрани еритроцитів. Такі поверхневі білки-рецептори називаються гемаглютиніни.

Через певний час еритроцит клітина “набирає” значну кількість вірусних частинок

Важкий комплекс віруси-еритроцит випадає в осад (зсідання еритроцитів або аглютинація)

 

Рис.10.1 Взаємодія вірусів з еритроцитами.

 

Здатність вірусів взаємодіяти з еритроцитами не тільки в макроорганізмі, але й в штучних системах (in vitro) дозволяє проводити такий вид серологічних реакцій як реакції гемаглютинації. Вперше проведена Херстом (1941р.) для вірусу грипу. Еритроцити осідають при безпосередній взаємодії з вірусами. Така взаємодія дозволяє визначити титр вірусу або кількість активних віріонів в суспензії, виготовленій з патологічного матеріалу.

Реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) та

Непрямої гемаглютинації (РНГА)

У вірусологічній практиці існує декілька варіантів постановки реакцій гемаглютинації. Вибір того чи іншого варіанту залежить від біологічних особливостей вірусу, наявності реагентів в лабораторії та інших причин (рис.10.2).

 

Варіанти реакції гемаглютинації
Реакція затримки гемаглютинації (РЗГА) Дозволяє ідентифікувати вірус або визначити титр(кількість специфічних) антитіл в сироватці крові	Реакція непрямої(пасивної) гемаглютинації (РНГА або РПГА) Розроблена Бернетом і Андерсоном (1946р.), доповнена Бойденом (1946 р.) Дозволяє ідентифікувати вірус або визначити наявність антитіл у тварини.
Сироватку із специфічними антитілами додають до вірусної суспензії. Утворюється комплекс антиген-антитіло. При додавання еритроцитів не спостерігається їх осідання (затримка гемаглютинації)	1. Еритроцити, навантажені вірусами (сенсибілізовані АГ еритроцити), додають до сироватки крові тварин. Комплементарні антитіла сироватки взаємодіють з вірусними АГ, закріпленими на еритроциті. Утворений комплекс випадає в осад. 2. Еритроцити з приєднаними антитілами (сенсибілізовані АТ еритроцити), додають до вірусовмісної суспензії. Утворюється комплекс Вірус + (АТ)– Еритроцит, що осідає.

 

Рис. 10.2 Варіанти реакцій гемаглютинації.

Методика постановки реакцій непрямої гемаглютинації (РНГА)

Обов’язковим компонентом РНГА є спеціально підготовані еритроцити (еритроцитарний діагностикум), методику підготовки якого наведено в табл.10.1. Взаємодія даного діагностикуму з вірусами дозволяє виявити ящур, аденовірусну інфекцію ВРХ, інфекційний ларінготрахеїт та інші хвороби.

Табл.10.1 Підготовка сенсибілізованих антигенами еритроцитів

 

№ Етапу	Назва етапу	Суть роботи
	Відбір крові барана або птиці (кури, індики)	Дефібринізація
	Фіксація еритроцитів формальдегідом, глутаровим або акриловим альдегідом	Взаємодія 2 год. при 37 ^оС, відмивка фізіологічним розчином. Еритроцити зберігаються без гемолізу.
	Взаємодія еритроцитів з таніном. 10-15 хв. при 37 ^оС, центрифугування, триразова промивка фосфатним буфером	Еритроцити здатні адсорбувати велику кількість білків
4.	Сенсибілізація еритроцитів вірусами.60 хв. при 37 ^оС, центрифугування, триразова промивка фосфатним буфером	Поверхня еритроцитів “вкрита” величезною кількістю вірусів