Быстрые тесты у постели больного

Общие положения. Одним из актуальных направлений научно-технического прогресса в лабораторной практике является миниатюризация аналитических технологий, что в ряде случаев сопровождается радикальным изменением привычного формата исследования.Новой диагностической технологией является иммунохроматографический анализ, который иногда называют простым быстрым тестом.

Принцип метода. В основу методов экспресс-диагностики хламидийной инфекции положены иммунохроматография и ферментспецифическая реакция. Метод позволяет выявлять в исследуемом материале антигены хламидий. В большинстве разработанных наборов применяются моно-или поликлональные антитела к антигену хламидий в том же качественном составе, что и в наборах реагентов для иммуноферментного анализа. Быстрые иммунохроматографические тесты, такие как Unipath Clearview и другие можно использовать у постели больного (Bed Side), при скрининговых исследованиях.

Чувствительность и специфичность. Тесты у постели больного не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью по сравнению с методами амплификации нуклеиновых кислот, хотя приемлемая чувствительность была доказана для Chlamydia Rapid Test (26).

Достоинства и недостатки метода. К числу достоинств данных методов относится простота и быстрота процедуры исследования, отсутствие потребности в специальном оборудовании, когда возможность проведения других методов диагностики отсутствует (27). Недостаток: широкое применение тестов ограничивается ввиду недостаточно высокой чувствительности и специфичности по сравнению с методами амплификации нуклеиновых кислот (26).

Оценка результатов Накопление в зоне учета результатов реакции иммунных комплексов, содержащих метки, приводит к образованию окрашенной полосы (розового цвета различной интенсивности), учитываемой визуально. При отсутствии антигенов хламидий в исследуемом образце окрашенной полосы не формируется. Правильность прохождения реакции проверяют по появлению цветной полосы в месте расположения контроля. Если окраска в этой зоне контроля не появляется, результат расценивают как «неопределенный», исследование повторяют с новой пробой клинического материала.

Источники ошибок:

· нарушение условий получения и транспортировки образцов;

· несоблюдение инструкций по применению тест-систем;

· несоблюдение сроков и условий хранения наборов и отдельных компонентов тест-систем.

Форма заключения результатов быстрых тестов у постели больного:

• Антиген, специфичный для Chlamydia trachomatis, выявлен.

· Антиген, специфичный для Chlamydia trachomatis, не выявлен

МолекулярнО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ методы диагностики

Общие положения. Развитие молекулярной биологии – открытие генетического кода, изучение структуры и роли нуклеиновых кислот ДНК и РНК, как хранилища генетической информации живой материи, - открыло новые возможности в изучении и диагностике микроорганизмов. Накапливаемые данные об организации геномов бактерий и вирусов, изучение генетического полиморфизма, идентификация уникальных и специфических для разных видов микроорганизмов участков генома послужили реализации идеи использования генетического материала в качестве мишени для диагностики возбудителей инфекций.

В настоящее время для выявления нуклеиновых кислот хламидий в образцах биологического материала предлагается значительное количество тест-систем, основанных на различных молекулярно-биологических подходах. В этой связи выбор тест-систем для использования в конкретной лаборатории представляет собой достаточно трудную задачу. При этом решающими должны быть не такие очевидные параметры, как стоимость и удобство в повседневной работе, а чувствительность и специфичность. К сожалению, исследования, посвященные сравнительной оценке тест-систем отечественного производства немногочисленны (28, 29). В сложившейся ситуации резко возрастают требования к внутрилабораторной валидации тест-систем.

 

Методы выявления нуклеиновых кислот можно разделить на две группы: связанные и не связанные с амплификацией нуклеиновых кислот.

Методы, не связанные с амплификацией нуклеиновых кислот

К основным методам, не связанным с амплификацией нуклеиновых кислот, относятся различные варианты методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот-мишеней и комплементарных зондов, содержащих радиоактивные или другие метки. Лучшим примером такого метода является тест PACE^® 2 CT (Gen-Probe, Inc. San Diego, CA), одобренный FDA 1988 году. Тест основан на гибридизации ДНК-зонда со специфическим участком 16S рибосомальной РНК C. trachomatis. В связи с относительно низкой чувствительностью указанный метод постепенно вытесняется амплификационными методами.

Чувствительность и специфичность: чувствительность – 70-85%, специфичность приближается к 100%.

Форма заключения:

· нуклеиновая кислота, характерная для C.trachomatis, обнаружена

· нуклеиновая кислота, характерная для C.trachomatis, не обнаружена

Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот

Разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) явилась поворотным моментом в развитии молекулярной диагностики. Хотя этот метод амплификации нуклеиновых кислот и остается наиболее распространенным, в настоящее время предложены и другие способы амплификации.

Все амплификационные методы можно разделить на три группы: основанные на амплификации сигнала, мишени и зонда.

Амплификация сигнала. При использовании методов амплификации сигнала, в ходе реакции увеличения концентрации мишени или зонда не происходит. Значительное повышение аналитической чувствительности метода достигается за счет связывания с мишенью множества меченых молекул. Один из вариантов этого подхода (hybrid capture assay – метод захвата гибридных молекул) используется в коммерческих тест-системах для выявления C. trachomatis – HC2^® CT ID (Qiagen Germantown, MD). Метод основан на гибридизации в растворе ДНК-мишени и РНК-зонда. Образовавшиеся гибридные молекулы захватываются иммобилизованными антигибридными антителами. Затем к иммобилизованным гибридным молекулам присоединяются антигибридные антитела, меченные щелочной фосфатазой. Реакция оценивается по интенсивности люминесценции, ее высокая чувствительность определяется тем, что к одной гибридной молекуле (ДНК+РНК) присоединяется множество молекул меченых антител.

Амплификация зонда. При использовании этих методов продукт амплификации представлен только нуклеотидными последовательностями, входящими в состав зонда. Наиболее известным вариантом этого метода является лигазная цепная реакция, реализованная в коммерческом продукте LCx Probe System (Abbott), однако в 2003 г производитель отозвал тест-систему с рынка.

Амплификация мишени. Все методы, относящиеся к этой группе, основаны на проведении энзиматических реакций, в процессе которых один или несколько ферментов синтезируют множественные копии нуклеиновой кислоты – мишени.

 

Классическая ПЦР

Принцип метода: Амплификация ДНК-мишени осуществляется в ходе повторяющихся циклов, каждый из которых включает:

· денатурацию (образование одноцепочечных молекул) ДНК-мишени при температуре более 90⁰С;

· отжиг на каждой одноцепочечной молекуле ДНК комплементарного олигонуклеотидного праймера при понижении температуры до 55⁰С – 65⁰С.

· достройка (синтез) двухцепочечной молекулы ДНК с каждого праймера в результате энзиматической активности термостабильной ДНК-полимеразы при использовании содержащихся в реакционной смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов при температуре 72⁰С.

По окончании цикла происходит удвоение фрагментов ДНК-мишени. При проведении n циклов количество фрагментов ДНК-мишени будет составлять 2ⁿ. На практике для получения продуктов амплификации (ампликонов) в количестве, достаточном для их детекции обычными аналитическими методами, проводят приблизительно 30 циклов амплификации. Первоначально в ходе ПЦР после каждого отжига праймеров в реакционную смесь приходилось добавлять новую порцию ДНК-полимеразы, так как ранее внесенный фермент инактивировался при высокой температуре на этапе денатурации. Высокую скорость реакции амплификации удалось получить при использовании термостабильной ДНК-полимеразы и благодаря созданию программируемых термоциклеров, обеспечивающих быстрое и точное изменение температуры реакционной смеси.

Для детекции продуктов амплификации применяют несколько методов.

Наиболее распространенным методом детекции является горизонтальный электрофорез образца реакционной смеси, полученного после окончания амплификации, в агарозном геле. Результат ПЦР считается положительным при выявлении фрагмента ДНК, по своей молекулярной массе соответствующего молекулярной массе ампликона контрольного образца. Для этого при проведении электрофореза необходимо использовать маркеры (фрагменты ДНК известной молекулярной массы), положительный и отрицательный контроли. Существенными недостатками метода являются: субъективность оценки результатов электрофореза оператором, низкая производительность, невозможность автоматизации процесса, трудность количественной оценки продуктов ПЦР в каждом конкретном образце. Наибольшую опасность составляет возможность наработки в ходе ПЦР неспецифического продукта, сходного по размерам с детектируемым продуктом. При существующей системе детекции возможна выдача оператором ложноположительного результата.

Альтернативой электрофоретическим методам детекции ПЦР-амплифицированной ДНК являются методы гибридизационно-флуоресцентной детекции. В ходе такого способа детекции амплифицированная ДНК гибридизуется и с праймерами, и с мечеными флуоресцентным красителем олигонуклеотидными зондами, специфичными к внутренней последовательности анализируемого фрагмента. Образовавшийся гибрид автоматически регистрируется флуоресцентным или фотометрическим ридером. Таким образом, при гибридизационном способе детекции ДНК специфичность реакции амплификации обеспечивается, во-первых, за счет гибридизации с праймерами, во-вторых, за счет гибридизации со специфическими зондами.

Метод ПЦР в его классическом варианте первоначально использовался для детекции ДНК C. trachomatis с помощью тест-систем, сконструированных в каждой лаборатории самостоятельно (домашнее изготовление). К настоящему времени такие тест-системы вытесняются коммерческими тест-системами. В большинстве тест-систем мишенью является криптическая плазмида или 23S рРНК C. trachomatis.

ПЦР в классическом варианте используется в коммерческих тест-системах производства Roche Molecular Diagnostics Pleasanton, CA (AMPLICOR^® CT/NG Test for Chlamydia trachomatis и COBAS AMPLICOR^® CT/NG Test for Chlamydia trachomatis). Мишенью в указанных тест-системах является криптическая плазмида. Существует ряд ПЦР– тест-систем производства Российской Федерации для детекции Chlamydia trachomatis, разрешенных к медицинскому применению.

Тест-системы, основанные на принципе классической ПЦР, являются наименее удобными в повседневной работе (особенно при ручном исполнении), но отличаются относительно низкой стоимостью.

Для повышения чувствительности и специфичности классической ПЦР был разработан ее вариант получивший название гнездной ПЦР. При этом используют две пары праймеров. После проведения амплификации с использованием первой пары праймеров полученные ампликоны используют во втором раунде ПЦР со второй парой праймеров. Вторая пара праймеров отжигается на внутренних участках ампликонов, таким образом, продукт второго раунда амплификации оказывается короче, чем продукт первого раунда. Повышение чувствительности и специфичности гнездной ПЦР достигается за счет увеличения общего количества циклов амплификации (по 15 – 30 в каждом раунде) и отжига второй пары праймеров только на фрагментах, полученных в первом раунде. Метод гнездной ПЦР используется в основном в исследовательских целях и не нашел широкого применения в коммерческих тест-системах.

С практической точки зрения, весьма перспективной является мультиплексная ПЦР. При этом варианте в одной и той же пробирке находятся несколько пар праймеров, специфичных для различных мишеней, что позволяет проводить детекцию нескольких мишеней одновременно. Конструирование праймеров и оптимизация условий для мультиплексной ПЦР несколько сложнее, чем решение этих задач для классической ПЦР, так как необходимо исключить возможную комплементарность между различными праймерами и обеспечить для них одинаковую температуру отжига. Мультиплексная ПЦР по чувствительности несколько уступает обычной реакции.