Жалобы пациентов, клинические проявления неосложненной урогенитальной хламидийной инфекции и осложнения урогенитальной хламидийной инфекции

Протоколы лабораторной диагностики инфекции, вызванной Chlamidia trachomatis (урогенитальной хламидийной инфекции): учеб.-метод. пособие / И. Шиманская, О. Панкратов, О. Кудина, Л. Журавская, М. Домейка, А. Савичева, Е. Соколовский, Н. Фриго, Т. Брилене, А. Халлен, М. Унемо, Р. Баллард, M. Bард. – Минск: БелМАПО, 2009. – 40 с.

СОДЕРЖАНИЕ

 

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………………2

ЭТИОПАТОГОНЕЗ И КЛАССИФИКАЦИЯ..……………………………….….......................3

КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА………………………………………………………….….……..5

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА……………....……...……………………………….…...7

Общие положения………………………………………..……………………………..…....7

ВЗЯТИЕ ОБРАЗЦОВ, ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА МАТЕРИАЛА………..……9

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ..……………………………..……………..14

Культуральная диагностика ……………...………………...……..….……………………14

Иммунологические методы диагностики….…………..………………………………….15

Методы выявления антигенов……………….……………………………………......15

Методы выявления антител……………………………………………………....…...18

Быстрые иммунохроматографические методы «у постели больного»………………….18

Молекулярно-биологические методы диагностики………………………………..……. 19

Методы, не связанные с амплификацией нуклеиновых кислот ………….…....…...20

Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот …………………......20

Источники ошибок при молекулярной диагностике………………….......................24

ВАЛИДАЦИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТОВ……………………………….……....…...25

ВЫВОДЫ……………….........……………………….…………………………………..…….26

ЛИТЕРАТУРА………......………………………………………………………………..…….27

 

ВВЕДЕНИЕ

Целью создания данного Протокола является стандартизация лабораторной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis

Настоящий протокол создан на основе согласительного документа, разработанного Восточно-Европейской Ассоциацией по охране сексуального и репродуктивного здоровья (1). Это один из серии протоколов, создание которых направлено на стандартизацию лабораторной диагностики инфекций репродуктивной системы (2, 3)в странах Восточной Европы. Настоящий документсодержит информацию для врачей и сотрудников лабораторий, осуществляющих лабораторную диагностику урогенитальной хламидийной инфекции.

Урогенитальная хламидийная инфекция передается половым путем при непосредственном контакте слизистых оболочек половых партнеров и поражает в основном сексуально активных подростков и людей молодого возраста (4). Так же возможен антенатальный и интранатальный пути передачи инфекции у беременных к плоду и новорожденным.

К факторам риска, увеличивающим возможность заражения урогенитальной хламидийной инфекцией, относятся: высокая сексуальная активность, в том числе с наличием большого числа и частой сменой половых партнеров (промискуитет); возраст моложе 25 лет; занятие коммерческим сексом, мужчины практикующие секс с мужчинами, наличие в анамнезе перенесенных ИППП, незащищенные половые контакты с новым половым партнером; половой контакт с больным урогенитальной хламидийной инфекцией и/или с уретритом/цервицитом; сексуальное насилие.

Распространенность урогенитальной хламидийной инфекции среди населения разных стран мира является высокой. По оценке ВОЗ, урогенитальный хламидиоз по частоте заболеваемости среди ИППП занимает второе место после трихомонадной инфекции. В мире ежегодно наблюдается более 90 млн. новых случаев инфицирования C. trachomatis, а экономический ущерб составляет десятки миллионов долларов. В странах Восточной Европы определение уровня заболеваемости этой инфекцией связано с определенными трудностями из-за имеющихся дефектов диагностики (5, 6, 7, 8). Основными направлениями деятельности по предупреждению распространения хламидийной инфекции является создание скрининговых программ, в особенности среди лиц моложе 25 лет. В ряде стран Европы (Швеция, Нидерланды, и др.) проводится объемный скрининг по урогенитальной хламидийной инфекции.

По полученным данным, распространенность заболевания в популяционной группе 18 -25 лет, на 60% выше в сравнении с другими возрастными группами (9).

На территории Республики Беларусь урогенитальная хламидийная инфекция подлежит обязательной регистрации начиная с 1998 года. В течение последних лет в заболеваемость урогенитальной хламидийной инфекцией вышла на первое место среди всех бактериальных инфекций, передаваемых половым путем, и в 2007 году составила 184 случая на 100 000 населения и стала второй по распространенности среди регистрируемых ИППП после трихомоноза.

Расходы национальных систем здравоохранения на лечение последствий, вызываемых урогенитальной хламидийной инфекцией, являются весьма существенными. Исследования экономической эффективности мероприятий по обследованию и лечению больных урогенитальной хламидийной инфекцией в развитых странах показали, что наилучшей стратегией в данном случае является ранняя диагностика и лечение неосложненной инфекции (10).

Бессимптомное течение урогенитальной хламидийной инфекции, наиболее часто наблюдаемое у женщин, вызывает необходимость применения качественной лабораторной диагностики, т.к. в данном случае диагноз нельзя установить только на основании жалоб и результатов клинического обследования пациенток. Кроме этого, в связи с тем, что больные с бессимптомным течением урогенитальной хламидийной инфекции не обращаются за медицинской помощью, представляется необходимым обследование пациентов, относящихся к группам высокого риска (11).

 

 

ЭТИОПАТОГЕНЕЗ И КЛАССИФИКАЦИЯ УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

 

Возбудителем урогенитальной хламидийной инфекцииявляется Chlamydia trachomatis - грамотрицательная внутриклеточная бактерия, относящаяся к порядку Chlamydiales. Современная номенклатура хламидий была предложена в 1999 г (12). К порядку Chlamydiales были отнесены облигатные внутриклеточные бактерии с уникальным двухфазным циклом развития и сходством 16S и 23S рРНК более чем 80%. Порядок был разделен на четыре семейства: Simkaniaceae, Waddliaceae, Chlamydiaceae и Parachlamydiaceae. Реальное значение в патологии человека в настоящее время признается только за представителями семейства Chlamydiaceae.

Было предложено также разделить семейство Chlamydiaceae на два рода: Chlamydia и Chlamydophila. К роду Chlamydophila были отнесены C. pneumoniae, C. psittaci и C. pecorum, а к роду Chlamydia - С. trachomatis, C. abortus и C. felis. У всех представителей Chlamydiaceae нуклеотидные последовательности генов 16S и 23S рРНК различаются менее чем на 10%.

ДНК C. trachomatis представлена кольцевой хромосомой и криптической плазмидой (7-10 копий).На основании вариабельности антигенных участков основного протеина внешней мембраны (major over membrane protein – MOMP) в составе вида C. trachomatis выделяют18 сероваров. В настоящее время установлено, что серовары C. trachomatis от A до С вызывают классическое заболевание глаз – трахому, тогда как серовары от D до K вызывают урогенитальную инфекцию и поражение глаз, а серовары L1, L2 и L3 – более инвазивную форму инфекции, передающуюся половым путем, - венерическую лимфогранулему с характерным поражением лимфатических узлов. Эталоном серотипирования является использование моноклональных антител, однако из-за значительной трудоемкости этот метод вытесняется молекулярными, основанными на секвенировании гена omp1, кодирующего указанный белок.

Инфицирование человека хламидиями начинается с эндоцитоза инфекционных, метаболически неактивных элементарных телец (ЭТ)диаметром 0,2-0,3 мкм, окруженных ригидной малопроницаемой клеточной стенкой, резистентных к факторам внешней среды. ЭТ прикрепляются к чувствительным клеткам - мишеням (эпителию урогенитального тракта) и поглощаются ими с формированием внутриклеточной вакуоли. Они реорганизуются в метаболически активные неинфекционные внутриклеточные формы - ретикулярные тельца (РТ), пластичные сферические клетки с диффузной укладкой ДНК нуклеоида и обводненным протопластом, содержащим рибосомы. Диаметр РТ 0.6-1.5 мкм. РТ используют субстраты клетки - хозяина для синтеза РНК, белка, протеинов, но не способны синтезировать энергетические субстраты - АТФ, ГТФ, являясь "энергетическими паразитами". Внутри образующейся эндосомы РТ размножаются путем бинарного деления, что, в конечном счете, приводит к увеличению количества инфекционных элементарных телец и гибели клетки хозяина (рисунок 1). Цикл развития C. trachomatis считается завершенным после выхода из клетки инфекционных ЭТ, что позволяет им вступать в новый жизненный цикл, распространяя инфекцию в еще не инфицированных клетках. Полный цикл развития хламидий при изучении in vitro на культуре чувствительных клеток длится 48-72 час, в зависимости от штамма хламидий, природы клеток-хозяев и условий среды. Цитоплазматические включения, содержащие хламидии, выявляются при световой, люминесцентной и фазово-контрастной микроскопии.

 

Рисунок 1. Цикл развития C. trachomatis в организме человека

Классификация урогенитальной хламидийной инфекции в соответствии с международной классификацией болезней (МКБ)10, переработанной и исправленной в издании 2007 года (13)представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Классификация урогенитальной хламидийной инфекции, вызываемой Chlamydia trachomatis

 

A55	Хламидийная лимфогранулема (венерическая)
A56	Другие хламидийные болезни, передающиеся половым путем
A56.0	Хламидийные инфекции нижних отделов мочеполового тракта
A56.1	Хламидийные инфекции органов малого таза и других мочеполовых органов
A56.2	Хламидийная инфекция мочеполового тракта неуточненная
A56.3	Хламидийная инфекция аноректальной области
A56.4	Хламидийный фарингит
A56.8	Хламидийные инфекции, передающиеся половым путем, другой локализации

 

С клинической точки зрения, урогенитальная хламидийная инфекция подразделяется на неосложненную (в случае развития уретрита у мужчин и уретрита и/или цервицита у женщин), и осложненную (когда диагностируют воспалительные заболевания органов малого таза у женщин и эпидидимоорхит у мужчин).

Задачей настоящего Протокола является изложение вопросов, касающихся лабораторной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции, вызываемой C. trachomatis сероваров от D до K и относящейся к разделу А56 классификации МКБ10, поэтому вопросы, касающиеся лабораторной диагностики хламидийной (венерической) лимфогранулемы, здесь не рассматриваются.

 

КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА

 

У мужчин заболевание, как правило, проявляется острым уретритом, у женщин - уретритом и/или цервицитом. При урогенитальной хламидийной инфекции могут наблюдаться также клинические проявления в виде проктита и фарингита, что наиболее часто отмечается у мужчин, имеющих секс с мужчинами. Нередко отмечается бессимптомное течение заболевания (у мужчин – в 40-50% случаев, у женщин – в 70-80%), что может приводить к позднему обращению пациентов к врачу и развитию серьезных осложнений со стороны репродуктивной системы: у женщин – к воспалительным заболеваниям органов малого таза и как следствие к развитю эктопической беременности, трубному бесплодию, у мужчин – к эпидидимитам. Роль C.trachomatis в развитии хронического простатита не доказана. Вне зависимости от пола пациента урогенитальная хламидийная инфекция может приводить к развитию реактивных артритов, в случаях оро-генитального контакта – к развитию фарингита, а при проникающем анальном контакте – проктита. Попадание выделений из полового тракта в глаза может приводить к возникновению конъюнктивита у взрослых. Урогенитальная хламидийная инфекция, развившаяся во время беременности и не пролеченная, может приводить к развитию конъюнктивита или пневмонии у новорожденного. В части случаев наблюдают спонтанную элиминацию хламидий, что необходимо учитывать при интерпретации результатов диагностических исследований. Жалобы пациентов, а также клинические проявления неосложненной урогенитальной хламидийной инфекции и осложнений урогенитальной хламидийной инфекции представлены в таблице 2.

 

Таблица 2.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Общие положения

Лабораторная диагностика урогенитальной хламидийной инфекции является ключевым моментом при установлении диагноза урогенитальной хламидийной инфекции, что обусловлено отсутствием при этом заболевании патогномоничной симптоматики и частым сочетанием инфекции с другими ИППП.

Большое значение для осуществления качественной лабораторной диагностики имеет правильность проведения преаналитического, аналитического и постаналитического этапов лабораторного обследования. Это касается методов получения, транспортировки и хранения биологического материала, подлежащего исследованию, выбора адекватного метода диагностики, интерпретации полученных результатов.

Для лабораторной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции в странах Восточной Европы до настоящего временииспользуют следующие методы, направленные на выявление возбудителя – C. trachomatis:

• бактериоскопический метод с окраской мазка по Гименезу или Романовскому–Гимза;
• иммунологические методы: выявление антигенов C. trachomatis (прямая иммунофлюоресценция - ПИФ; реже - иммуноферментный анализ - ИФА);
• культуральный метод (выделение хламидий на клеточных линиях L-929, Mc Coy, Hela и др.).
• молекулярно-биологические методы, направленные на выявление нуклеиновых кислот C. trachomatis.

Широко применяются также серологические методы выявления антител к C. trachomatis.

Однако многие из перечисленных методов, направленных на выявление возбудителя, являются устаревшими и по своим параметрам в настоящее время не могут быть рекомендованы для установления диагноза урогенитальной хламидийной инфекции ввиду низкой чувствительности и высокой вероятности получения ложноотрицательного и ложноположительного результатов.

Выявление антител к хламидиям может свидетельствовать о ранее перенесенном заболевании и не всегда адекватно отражает активность и динамику воспалительного процесса.

Основные клинические показания для обследования на урогенитальную хламидийную инфекцию представлены в таблице 3.

Показания для обследования на урогенитальную хламидийную инфекцию при отсутствии клинических проявлений:

· прерывание беременности;

· внутриматочные манипуляции;

· обследование доноров спермы;

· при проведении репродуктивных технологий (экстракорпоральное оплодотворение и его модификации, амниоцентез, биопсия ворсин хориона);

· в случае сексуального насилия.

 

Таблица 3.

Таблица 4.

Хламидийной инфекции

 

Анатоми-ческая область или вид материала	Способ взятия материала	Комментарии
Уретра у мужчин	· ввести тампон в уретру (на 3-4 см); · тампон слегка повращать в уретре в течение нескольких секунд.	· детям препубертатного возраста брать материал из уретры не рекомендуется; · отделяемое берется исключительно из наружного отверстия мочеиспуска-тельного канала маленьким тампоном или собирается моча для исследова-ния методами определения ДНК/РНК.
Уретра у женщин	· при наличии большого количества выделений наруж-ное отверстие очистить с помощью марлевого тампона; · ввести тампон в уретру (на 1-2 см); · тампон слегка повращать в уретре в течение нескольких секунд.	· детям препубертатного возраста брать материал из уретры не рекомендуется; · отделяемое берется исключительно из наружного отверстия мочеиспускательного канала маленьким тампоном или собира-ется моча для исследования методами определения ДНК/РНК.
Эндоцер-викс	· тщательно очистить наруж-ное отверстие цервикального канала от вагинальных выделе-ний при помощи большого ватного тампона; · очистить наружное отвер-стие цервикального канала от вагинальных выделений сте-рильным ватным тампоном или большим марлевым тампоном; · ввести тампон в цервикаль-ный канал на 1-2 см, повращать его в цервикальном канале в течение 15 секунд и вынуть.	· цервикальные мазки не берутся у дево-чек препубертатного возраста. При подо-зрении на хламидийную инфекцию в этом возрасте мазки берутся из влагалища через естественное отверстие гименального коль-ца, а также собирается моча для исследо-вания; · беременные женщины могут проходить обследование на хламидии на любом сроке беременности. Взятие материала проводится из уретры и цервикального канала. У родильниц материал берется из уретры, на 3 день после родов – из цервикального канала. У женщин после экстирпации матки материал на C. trachomatis берется из уретры и влагалища.
Влагалище (например, при взятии образца са- мим паци-ентом*, и у девочек препубер-татного возраста)	· зеркала не используются; · тампон осторожно вводится во влагалище, и материал берется с задней стенки влагалища;
Конъюнктива	· при наличии гнойного отде-ляемого оно удаляется стериль-ным ватным тампоном; · отводится нижнее веко и тампон проводится по поверх-ности конъюнктивы нижнего века по направлению к внутреннему углу глаза.	· процедура иногда бывает болезненной, поэтому можно применять местные анестетики.
Прямая кишка	· тампон вводят на глубину 2 – 3 см в канал и получают материал со всех стенок прямой кишки по направлению изнутри кнаружи, а затем круговыми движениями	Клинический материал из прямой кишки берется: · у пациентов, имевших анальный секс или при подозрении на него; · при проявлениях (субъективных и объек-тивных) проктита, в том числе при наличии слизисто-гнойных выделений из прямой кишки; Материал для исследования из прямой кишки получают с помощью: · ректоскопа под визуальным контролем (более эффективен), · ректальных зеркал, · «слепым» методом – из анального канала. · При наличии на тампоне видимых каловых масс тампон выбрасывается и проводится повторная попытка получения материала. При использовании ректоскопа риск контаминации каловыми массами ниже и сбор материала производится под контролем глаза.
Носоглотка	· тампоном проводят по задней стенке глотки выше нижнего края мягкого неба, а также по поверхности миндалин	· Фарингеальные образцы берутся у пациентов, имевших оро-генитальный контакт или при подозрении на него.
Моча	· Производится забор первой порции мочи пациента (первые 10 – 15 мл) после задержки мочеиспускания не менее 2 часов	· Образцы мочи могут исследоваться при необходимости обследования пациентов неинвазивными методами (например, детей) с применением технологии МАНК.

· МАНК для диагностики урогенитальной хламидийной и гонококковой инфекции при исследовании влагалищных образцов, полученных самими пациентами, высоко чувствительны и специфичны, а сама процедура получения материала хорошо воспринимается пациентами (16, 17, 18, 19)

 

Хламидии являются микроорганизмами, очень требовательными к соблюдению надлежащих условий их транспортировки (состав транспортной среды, температура, при которой осуществляется доставка и хранение материала, длительность транспортировки и хранения), поэтому условия транспортировки должны соблюдаться очень точно.В случае несоблюдения правил взятия и условий доставки биологического материала (разбитые, не промаркированные, склеенные друг с другом стекла, отсутствие материала на стекле) образцы не подлежат исследованию; об этом сообщается врачу, направившему биологический материал на исследование; разбитые стекла подлежат уничтожению.При взятии и транспортировке материала для проведения молекулярно-биологических и иммунологических методов исследования на C. trachomatis и использовании рекомендуемой для этого транспортной среды необходимо четко соблюдать инструкцию производителяиспользуемой тест-системы. Рекомендации по транспортировке и хранению образцов, используемых для проведения разных диагностических методов для выявления C. trachomatis приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Рекомендации по транспортировке и хранению образцов, используемых для основных методов диагностики урогенитальной хламидийной инфекции

Метод исследования	Условия транспортировки и хранения образцов
Молекулярно-биологический (методы амплификации нуклеиновых кислот - МАНК)	· Образцы могут транспортироваться и храниться в транспортной среде, предоставленной производителем, в других случаях (для большинства тестов) - в среде 2 SP (с добавлением антибиотиков) или сухими (14, 15); · в других случаях во время транспортировки материала в лабораторию образцы должны находиться в сумке-холодильнике при +6±2^оC. Образцы мочи могут храниться при +6±2^оC в течение одной недели и их не надо замораживать.
Иммунологический: прямая иммунофлюоресценция (ПИФ)	· Стекла с мазками клинического материала для ПИФ, взятые врачом - клиницистом, необходимо в тот же день доставить в лабораторию; · мазок может быть фиксирован в течение 1-2 минут холодным ацетоном на месте взятия материала, в этом случае его можно хранить при +6±2^оC в течение 3 дней, при – 20^оС – в течение 1 месяца.
Иммунологический: иммуно- ферментный анализ для определения антигена хламидий (ИФА)	· Материал должен собираться в специальную транспортную среду, которая до момента отправки в лабораторию хранится при +4^оC - +8^оC. Если время транспортировки соскобного материала с момента его взятия до момента доставки в лабораторию составляет более 2-х часов, то пробирку необходимо заморозить при –20^оC.
Культуральный (культура клеток)	· До транспортировки материал следует поместить в специальную транспортную среду (например, 2SP с добавлением антибиотиков) и хранить в холодильнике при +6±2^оC и в течение 24 часов доставить в лабораторию в сумке-холодильнике; · исследование требует сохранения живых хламидий, и изменение температуры при транспортировке может быть решающим для получения достоверного результата; · в лаборатории пробы хранятся при +6±2^оC в течение 24 часов. В случае необходимости выделенную культуру C. trachomatis можно хранить в среде 2SP в низкотемпературной морозильной камере (-70^0С).

 

Классическая ПЦР

Принцип метода: Амплификация ДНК-мишени осуществляется в ходе повторяющихся циклов, каждый из которых включает:

· денатурацию (образование одноцепочечных молекул) ДНК-мишени при температуре более 90⁰С;

· отжиг на каждой одноцепочечной молекуле ДНК комплементарного олигонуклеотидного праймера при понижении температуры до 55⁰С – 65⁰С.

· достройка (синтез) двухцепочечной молекулы ДНК с каждого праймера в результате энзиматической активности термостабильной ДНК-полимеразы при использовании содержащихся в реакционной смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов при температуре 72⁰С.

По окончании цикла происходит удвоение фрагментов ДНК-мишени. При проведении n циклов количество фрагментов ДНК-мишени будет составлять 2ⁿ. На практике для получения продуктов амплификации (ампликонов) в количестве, достаточном для их детекции обычными аналитическими методами, проводят приблизительно 30 циклов амплификации. Первоначально в ходе ПЦР после каждого отжига праймеров в реакционную смесь приходилось добавлять новую порцию ДНК-полимеразы, так как ранее внесенный фермент инактивировался при высокой температуре на этапе денатурации. Высокую скорость реакции амплификации удалось получить при использовании термостабильной ДНК-полимеразы и благодаря созданию программируемых термоциклеров, обеспечивающих быстрое и точное изменение температуры реакционной смеси.

Для детекции продуктов амплификации применяют несколько методов.

Наиболее распространенным методом детекции является горизонтальный электрофорез образца реакционной смеси, полученного после окончания амплификации, в агарозном геле. Результат ПЦР считается положительным при выявлении фрагмента ДНК, по своей молекулярной массе соответствующего молекулярной массе ампликона контрольного образца. Для этого при проведении электрофореза необходимо использовать маркеры (фрагменты ДНК известной молекулярной массы), положительный и отрицательный контроли. Существенными недостатками метода являются: субъективность оценки результатов электрофореза оператором, низкая производительность, невозможность автоматизации процесса, трудность количественной оценки продуктов ПЦР в каждом конкретном образце. Наибольшую опасность составляет возможность наработки в ходе ПЦР неспецифического продукта, сходного по размерам с детектируемым продуктом. При существующей системе детекции возможна выдача оператором ложноположительного результата.

Альтернативой электрофоретическим методам детекции ПЦР-амплифицированной ДНК являются методы гибридизационно-флуоресцентной детекции. В ходе такого способа детекции амплифицированная ДНК гибридизуется и с праймерами, и с мечеными флуоресцентным красителем олигонуклеотидными зондами, специфичными к внутренней последовательности анализируемого фрагмента. Образовавшийся гибрид автоматически регистрируется флуоресцентным или фотометрическим ридером. Таким образом, при гибридизационном способе детекции ДНК специфичность реакции амплификации обеспечивается, во-первых, за счет гибридизации с праймерами, во-вторых, за счет гибридизации со специфическими зондами.

Метод ПЦР в его классическом варианте первоначально использовался для детекции ДНК C. trachomatis с помощью тест-систем, сконструированных в каждой лаборатории самостоятельно (домашнее изготовление). К настоящему времени такие тест-системы вытесняются коммерческими тест-системами. В большинстве тест-систем мишенью является криптическая плазмида или 23S рРНК C. trachomatis.

ПЦР в классическом варианте используется в коммерческих тест-системах производства Roche Molecular Diagnostics Pleasanton, CA (AMPLICOR^® CT/NG Test for Chlamydia trachomatis и COBAS AMPLICOR^® CT/NG Test for Chlamydia trachomatis). Мишенью в указанных тест-системах является криптическая плазмида. Существует ряд ПЦР– тест-систем производства Российской Федерации для детекции Chlamydia trachomatis, разрешенных к медицинскому применению.

Тест-системы, основанные на принципе классической ПЦР, являются наименее удобными в повседневной работе (особенно при ручном исполнении), но отличаются относительно низкой стоимостью.

Для повышения чувствительности и специфичности классической ПЦР был разработан ее вариант получивший название гнездной ПЦР. При этом используют две пары праймеров. После проведения амплификации с использованием первой пары праймеров полученные ампликоны используют во втором раунде ПЦР со второй парой праймеров. Вторая пара праймеров отжигается на внутренних участках ампликонов, таким образом, продукт второго раунда амплификации оказывается короче, чем продукт первого раунда. Повышение чувствительности и специфичности гнездной ПЦР достигается за счет увеличения общего количества циклов амплификации (по 15 – 30 в каждом раунде) и отжига второй пары праймеров только на фрагментах, полученных в первом раунде. Метод гнездной ПЦР используется в основном в исследовательских целях и не нашел широкого применения в коммерческих тест-системах.

С практической точки зрения, весьма перспективной является мультиплексная ПЦР. При этом варианте в одной и той же пробирке находятся несколько пар праймеров, специфичных для различных мишеней, что позволяет проводить детекцию нескольких мишеней одновременно. Конструирование праймеров и оптимизация условий для мультиплексной ПЦР несколько сложнее, чем решение этих задач для классической ПЦР, так как необходимо исключить возможную комплементарность между различными праймерами и обеспечить для них одинаковую температуру отжига. Мультиплексная ПЦР по чувствительности несколько уступает обычной реакции.

 

Выводы

1. Для постановки диагноза урогенитальной хламидийной инфекции рекомендуeтся использова т ь валидированныe и разрешенные к применению методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК).

2. Для рутинной диагностики урогенитальной хламидийной инфтекции не рекомендуется использование культурального метода и методов основанных на выявл е нии антигенов хламидий. Культуральный метод может быть использован для научно-исследовательских целей; и (редко) для судебно-медицинской экспертизы.

3. Выявление антител к хламидиям для рутинной диагностики хламидийной инфекции урогенитального тракта не рекомендуется. Метод может использоваться для научно-исследовательских целей.

4. Экспресс-тесты у постели больного при наличии соответствующей лабораторной службы не рекомендуются для использования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Domeika M, Savicheva A, Sokolovskiy E, Ballard R, Unemo M. Guidelines for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae infections in Eastern European countries - results of an international collaboration. Euro Surveill. 2007 Dec 6;12(12):E071206.3.

2. Savicheva A., Sokolovsky E., Frigo N., Priputnevich T., Brilene T., Deák J., Ballard R., Ison C., Hallén A., Domeika M., Unemo M. Guidelines for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in East-European countries. Part 2: culture, non-culture methods, determination of antibiotic resistance, and quality assurance. Acta Medica Lituanica, 2007, Vol 4, No 2, 123-34 //Available at: http://images.katalogas.lt/maleidykla/Act72/Act_123_134.pdf //

3. Savicheva A., Sokolovsky E., Frigo N., Priputnevich T., Brilene T., Deák J., Ballard R., Ison C., Hallén A., Domeika M., Unemo M. Guidelines for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in East-European countries. Part 1: gonorrhoea, sampling, and microscopy for diagnosis. Acta Medica Lituanica, 2007, Vol 4, No 1, 65-74 //Available at: http://images.katalogas.lt/maleidykla/Act71/ActaMed14_065-074.pdf//

4. CDC. Sexually Transmitted Disease Surveillance, 2004. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services, CDC, National Center for HIV, STD, and TB Prevention; 2005

5. Domeika M, Hallén A, Karabanov L, Chudomirova K, Gruber F, Unzeitig V, Pöder A, Deak J, Jakobsone I, Lapinskaite G, Dajek Z, Akovbian V, Gomberg M, Khryanin A, Savitcheva A, Takac I, Glazkova L, Vinograd N, Nedeljkovic M. Chlamydia trachomatis infections in eastern Europe: legal aspects, epidemiology, diagnosis, and treatment. Sex Transm Infect. 2002 Apr;78(2):115-9.

6. Naaber P, Uusküla A, Naaber J, Põder A, Hjelm E, Hallén A, Unemo M, Domeika M. Laboratory diagnosis of sexually transmitted infections in Estonia in 2001-2002: shortcomings with impact on diagnostic quality and surveillance. Sex Transm Dis. 2005 Dec;32(12):759-64.

7. Vagoras A, Butylkina R, Juseviciute V, Hallén A, Unemo M, Domeika M. Diagnosis of non-viral sexually transmitted infections in Lithuania and international recommendations. Euro Surveill. 2006 Jul;11(7):161-4.

8. Domeika M, Litvinenko I, Smirnova T, Gaivaronskaya O, Savicheva A, Sokolovskiy E, Ballard RC, Unemo M. Laboratory diagnostics for non-viral sexually transmitted infections in St. Petersburg, Russia: current situation and hallmarks for improvements. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2008 Apr 9. [Epub ahead of print]

9. Kohl KS, Markowitz LE, Koumans EH. Developments in the screening for Chlamydia trachomatis: a review. Obstet Gynecol Clin North Am. 2003 Dec;30(4):637-58. Review.

10. Kamwendo F, Forslin L, Bodin L, Danielson D. Decreasing incidences of gonorrhea- and chlamydia-associated acute pelvic inflammatory disease: a 25-year study from an urban area of central Sweden. Sex Transmit Dis 1996;23:384–91

11. CDC. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2006. MMWR, 2006, Vol. 55. 100 p

12. Everett KD, Bush RM, Andersen AA. Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int J Syst Bacteriol. 1999 Apr;49 Pt 2:415-40

13. WHO. Infections with a predominantly sexual mode of transmission, Certain Infectious and Parasitic Diseases, International Classification of Diseases, 10 revision, 2007. Availabe at: http://www.who.int/classifications/apps/icd/icd10online/

14. Kellogg JA, Seiple JW, Klinedinst JL, Stroll ES, Cavanaugh SH. Improved PCR detection of Chlamydia trachomatis by using an altered method of specimen transport and high-quality endocervical specimens. J Clin Microbiol. 1995 Oct;33(10):2765-7;

15. Domeika M, Drulyte O. Use of PCR for the detection of genital Chlamydia trachomatis infection on self-obtained mailed vaginal samples. Acta Obstet Gynecol Scand. 2000 Jul;79(7):570-5

16. Domeika M, Hallen A, Drulyte O. Genital Chlamydia trachomatis infections in Lithuanian women invited for screening via newspaper advertisement: a pilot study. Sex Transm Infect. 2000 Jun;76(3):216

17. Domeika M, Bassiri M, Butrimiene I, Venalis A, Ranceva J, Vasjanova V. Evaluation of vaginal introital sampling as an alternative approach for the detection of genital Chlamydia trachomatis infection in women. Acta Obstet Gynecol Scand. 1999 Feb;78 (2):131-6

18. Kucinskiene V, Juseviciute V, Valiukeviciene S, Milasauskiene Z, Unemo M, Domeika M. Home sampling and pooling of vaginal samples are effective tools for genetic screening of Chlamydia trachomatis among high school female students in Lithuania. Scand J Infect Dis. 2007 Sep 6;:1-6;

19. Hobbs MM, van der Pol B, Totten P, Gaydos CA, Wald A, Warren T, Winer RL, Cook RL, Deal CD, Rogers ME, Schachter J, Holmes KK, Martin DH. From the NIH: Proceedings of a Workshop on the Importance of Self-Obtained Vaginal Specimens for Detection of Sexually Transmitted Infections. Sex Transm Dis. 2008 Jan;35(1):8-13.

20. Ripa KT, Mårdh PA.Cultivation of Chlamydia trachomatis in cycloheximide-treated McCoy cells. J Clin Microbiol. 1977 Oct;6(4):328-31.

21. Ripa T, Nilsson PA. A Chlamydia trachomatis strain with a 377-bp deletion in the cryptic plasmid causing false-negative nucleic acid amplification tests. Sex Transm Dis. 2007 May;34(5):255-6.

22. Unemo M, Olcén P, Agné-Stadling I, Feldt A, Jurstrand M, Herrmann B, Persson K, Nilsson P, Ripa T, Fredlund H. Experiences with the new genetic variant of Chlamydia trachomatis in Orebro county, Sweden - proportion, characteristics and effective diagnostic solution in an emergent situation. Euro Surveill. 2007 Apr 1;12(4):E5-6.

23. Domeika M. Diagnosis of infections due to Chlamydia trachomatis. Acta Obstet Gynecol Scand Suppl. 1997;164:121-7.

24. Schachter J. Which test is best for chlamydia? Curr Opin Infect Dis. 1999 Feb;12(1):41-5.

25. Robinson AJ, Ridgway GL. Modern diagnosis and management of genital Chlamydia trachomatis infection. Br J Hosp Med, 1996, 55: 388-93

26. Mahilum-Tapey, L., Laitila, V., Wawrzyniak, J. J., Alexander, S., Ison, C., Swain, A., Barber, P., Ushiro-Lumb, I. & Gih, B. T.(2007). New point of care Chlamydia Rapid Test--bridging the gap between diagnosis and treatment: performance evaluation study. British Medical Journal 335, 1190 - 1194. Epub 2007 Nov 30.

27. Herring A, Ballard R, Mabey D, Peeling RW; WHO/TDR Sexually Transmitted Diseases Diagnostics Initiative. Evaluation of rapid diagnostic tests: chlamydia and gonorrhoea. Nat Rev Microbiol. 2006 Dec;4(12 Suppl):S41-8.

28. Shalepo K, Savicheva A, Shipitsyna E, Unemo M, Domeika M. Diagnosis of Chlamydia trachomatis in Russia--in-house PCR assays may be effective but overall optimization and quality assurance are urgently needed. APMIS. 2006 Jul-Aug;114(7-8):500-7.

29. Shipitsyna E., Zolotoverkhaya E., Agne-Stadling I., Krysanova A., Savicheva A., Sokolovskiy E., Domeika M., Unemo M. First evaluation of six nucleic acid amplification tests (NAATs) widely used in the diagnosis of Сhlamydia trachomatis in Russia. JEADV, 2008 (in press)

30. Little et al., 1999 SDA

31. Savage EJ, Ison CA, van de Laar MJ; ESSTI network.Results of a Europe-wide investigation to assess the presence of a new variant of Chlamydia trachomatis. Euro Surveill. 2007 Oct 1;12(10):E3-4.

32. Morré S. Catsburg A., Dommelen L, Smelov V, Vries H.J.C. de, Savitcheva A., Domeika M., Herrmann B., Ouburg S., Hoebe CJPA, Nilsson A., Savelkoul PHM, Morre SA. TaqMan Assay for Swedish Chlamydia trachomatis Variant. Emerging Infectious Diseases. 2007, Vol. 13, No. 9, 1432-4 //Available at: www.cdc.gov/eid //

33. Butylkina R, Juseviciute V, Kasparaviciene G, Vagoras A, Pagirskas E, Unemo M, Domeika M. Pooling of urine specimens allows accurate and cost-effective genetic detection of Chlamydia trachomatis in Lithuania and other low-resource countries. Scand J Infect Dis. 2007; 39 (3): 209-12.

34. Shipitsyna E, Shalepo K, Savicheva A, Unemo M, Domeika M. Pooling samples: the key to sensitive, specific and cost-effective genetic diagnosis of Chlamydia trachomatis in low-resource countries. Acta Derm Venereol. 2007;87(2):140-3

35. Banoo S, Bell D, Bossuyt P, Herring A, Mabey D, Poole F, Smith PG, Sriram N, Wongsrichanalai C, Linke R, O'Brien R, Perkins M, Cunningham J, Matsoso P, Nathanson CM, Olliaro P, Peeling RW, Ramsay A; TDR Diagnostics Evaluation Expert Panel. Evaluation of diagnostic tests for infectious diseases: general principles. Nat Rev Microbiol. 2006 Dec;4(12 Suppl):S20-32.

36. Peeling RW., Smith PG., Bossuyt PMM. A guide for diagnostic evaluations. Nat Rev Microbiol. 2006 Dec;4(12 Suppl):S 52-56.

37. Warford A., Cgernesky M., Peterson E. M., Gleaves C.A. Laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Cumulative techniques and procedures in clinical microbiology. 19A. ASM Press, Washington, 1999, 18p.

 

 

Настоящий Протокол разработан в сотрудничестве с диагностической группой по ИППП, Международной сети специалистов по сексуальному и репродуктивному здоровью (East European Network for Sexual and Reproductive Health, EE SRH). Международная сеть специалистов является проектом, поддерживаемым Шведским агентством международного развития и кооперации. Руководитель проекта – Марюс Домейка, Уппсальский университет, Восточно-европейский комитет Шведского общества охраны здоровья.

Протоколы лабораторной диагностики инфекции, вызванной Chlamidia trachomatis (урогенитальной хламидийной инфекции): учеб.-метод. пособие / И. Шиманская, О. Панкратов, О. Кудина, Л. Журавская, М. Домейка, А. Савичева, Е. Соколовский, Н. Фриго, Т. Брилене, А. Халлен, М. Унемо, Р. Баллард, M. Bард. – Минск: БелМАПО, 2009. – 40 с.

СОДЕРЖАНИЕ

 

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………………2

ЭТИОПАТОГОНЕЗ И КЛАССИФИКАЦИЯ..……………………………….….......................3

КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА………………………………………………………….….……..5

ЛА