Основы микробиологической диагностики

Диагностический процесс в бактериологии складывается из четырех основных этапов:

I – формулировка задачи и выбор метода исследования;

II – выбор и взятие исследуемого материала, его хранение и транспортировка;

III – проведение исследований;

IV – анализ полученных результатов.

Различают следующие методы лабораторной диагностики заболеваний микробной природы:

I. Методы, основанные на выявлении инфекционных агентов (бактерий, вирусов, грибов, простейших и т.д.):

1) микроскопические методы (базируются на прямом обнаружении возбудителя в патологическом материале с помощью различных приемов микроскопии);

2) бактериологические (основаны на культивировании возбудителя на питательных средах или на культурах тканей с целью выделения его в чистой культуре и последующей идентификации);

3) биологические (целью является воспроизведение инфекционного заболевания в организме восприимчивых животных с последующим выделением чистой культуры возбудителя и ее идентификацией);

4) методы, позволяющие обнаружить в исследуемом материале соединения, синтезированные микроорганизмы (летучие жирные кислоты при диагностике инфекций, обусловленных неспорообразующими анаэробами или токсин при диагностике ботулизма);

5) иммунологические методы поиска антигенов возбудителей в исследуемом материале с помощью серологических реакций с использованием диагностических сывороток (сероидентификация);

6) генетические методы, основанные на обнаружении нуклеиновых кислот возбудителя в пробе.

II. Методы исследования активного иммунитета направлены, чаще всего на выявление нарастания титров антител к возбудителям в сыворотке крови больных (серодиагностика) или на обнаружение сенсибилизации организма больного (аллергодиагностика).

III. Неспецифические лабораторные тесты, по характеру отклонений выявленных показателей от нормальных позволяют обнаружить патологические изменения, характерные для инфекционных процессов определенной этиологии (например, наличие изменение активности трансаминаз при вирусных гепатитах).

2. Стерилизация, дезинфекция; определение, методы, контроль, практическое применение. Понятие
Об асептике и антисептике.

Стерилизация — это полное освобождение объектов окружающей среды от микроорганизмов и их спор. Существуют физические, химические и механические способы стерилизации.

К наиболее распространенным способам физической стерилизации относятся автоклавирование и сухожаровая стерилизация.

К наиболее распространенным способам физической стерилизации относятся автоклавирование и сухожаровая стерилизация.

Автоклавирование — это обработка паром под давлением, которая проводится в специальных приборах — автоклавах. Автоклав представляет собой металлический цилиндр с прочными стенками, состоящий из двух камер: парообразующей и стерилизующей. В автоклаве создается повышенное давление, что приводит к увеличению температуры кипения воды. Паром под давлением стерилизуют питательные среды, патологический материал, инструментарий, белье и т.д.

Наиболее распространенный режим работы автоклава — 2 атм., 120°С, 15—20 мин. Началом стерилизации считают момент закипания воды.

К работе с автоклавом допускаются подготовленные специалисты, которые точно и строго выполняют все правила работы с этим прибором.

Сухожаровая стерилизация — проводится в печах Пас-тера. Это шкаф с двойными стенками, изготовленный из металла и асбеста, нагревающийся с помощью электриче-

ства и снабженный термометром. Сухим жаром стерилизуют, в основном, лабораторную посуду. Обеззараживание материала в нем происходит при 160°С в течение 1 часа.

В бактериологических лабораториях используется такой вид стерилизации, как прокаливание над огнем. Этот способ применяют для обеззараживания бактериологических петель, шпателей, пипеток. Для прокаливания над огнем используют спиртовки или газовые горелки. К физическим способам стерилизации относятся также УФ-лучи и рентгеновское излучение. Такую стерилизацию проводят в тех случаях, когда стерилизуемые предметы не выдерживают высокой температуры.

Механическая стерилизация — проводится при помощи фильтров (керамических, стеклянных, асбестовых) и особенно мембранных ультрафильтров из коллоидных растворов нитроцеллюлозы. Такая стерилизация позволяет освобождать жидкости (биопрепараты, сыворотку крови, лекарства) от бактерий, грибов, простейших и вирусов, в зависимости от размеров пор фильтра. Для ускорения фильтрации создают повышенное давление в емкости с фильтруемой жидкостью или пониженное давление в емкости с фильтратом.

В микробиологической практике часто используют асбестовые фильтры Зейтца, Шамберлана. Такие фильтры рас-читаны на одноразовое применение.

Химическая стерилизация — этот вид стерилизации применяется ограниченно. Чаще всего используют химические вещества для предупреждения бактериального загрязнения питательных сред и иммунобиологических препаратов.

При химической стерилизации возможно использование двух токсичных газов: окиси этилена и формальдегида. Эти вещества в присутствии воды могут инактивировать ферменты, ДНК и РНК, что приводит бактериальные клетки к гибели. Стерилизация газами осуществляется в присутствии пара при 50—80°С в специальных камерах. Этот вид стерилизации опасен для окружающих, однако существуют объекты, которые могут быть повреждены при нагревании и по-

этому их можно стерилизовать только газом. Например, оптические приборы, некоторые питательные среды.

Для проведения стерилизации тех или иных объектов необходимо строго соблюдать установленный режим стерилизации (например, для питательных сред он указан в рецепте приготовления).

При проведении стерилизации в автоклаве необходимо осуществлять контроль стерилизации.

Существует 3 вида контроля:

* химический — в автоклав при каждой загрузке кладут бензойную кислоту, мочевину, запаянные в ампулы, или индикаторы стерилизации ТВИ — 120°С — 1 атм, ТВИ - 132°С - 2 атм.

При достижении заданного режима стерилизации указанные вещества меняют свой цвет, а термовременные индикаторы темнеют;

термический — 2 раза в месяц максимальным термометром во время стерилизации проводят замер температуры в контрольных точках, которая должна достичь заданных параметров;

* биологический — проводится 2 раза в год. В контрольных точках помещают пробирки со споровой культурой Bacillus stearothermophilies, погибающей при 120°С в течение 15 мин. После стерилизации пробирки помещают в термостат при t = 55 °С на 48 часов. При достижении заданного режима рост тесткульту-ры отсутствует: фиолетовой цвет среды в пробирках не меняется.

Для сохранения стерильности стерилизуемые предметы должны иметь упаковку, не допускающую микробного загрязнения.

3. Возбудитель чумы

В этот род включены 3 вида бактерий: Y. pestis — возбудитель чумы; Y. pseudotuberculosis — возбудитель псевдотуберкулеза и Y. enterocolitica — возбудитель персиноза.

Представители этого рода являются подвижными или неподвижными палочками, спор не образуют, капсул не имеют, факультативные анаэробы, паразитируют в организме человека и животных. Хорошо растут на простых питательных средах.

Типовой вид Y. pestis — возбудитель чумы.

Морфологические и культуральные свойства. Чумная бактерия неподвижна, спор и капсул не образует. Молодые колонии имеют неровные края («кружевной платочек»), зрелые колонии — неровные края в виде «ромашки». На скошенном агаре через 48 часов при 28° С образуют серовато-белый налет, врастающий в среду. На бульоне через 48 часов образуют пленку на поверхности и хлопьевидный осадок.

Y. enterocolitica на плотных средах образует мелкие, блестящие, голубоватые колонии. На среде Эндо они имеют розоватый оттенок. На жидких средах образуют равномерное помутнение.

Y. pseudotuberculosis образуют бесцветные колонии на среде Эндо. Часто колонии выпуклые, бугристые и по внешнему виду могут напоминать колонии Y. pestis.

Opt — температура роста для персиний 28°С, рН — 5,0— 8,0.

Антигенная структура. Все виды персиний имеют О-ан-тиген (эндотоксин), который является очень токсичным для животных и человека. Методом преципитации в агаре у возбудителя чумы обнаружены антигены, общие с псевдотуберкулезными, кишечнотифозными, дизентерийными бактериями.

Резистентность. Возбудитель чумы очень устойчив к низким температурам, на предметах и одежде может сохранять свою жизнеспособность до 6 месяцев, в воде и мокроте — 10—30 суток, в молоке — до 3 месяцев. Возбудитель чумы очень чувствителен к высыханию и действию высоких температур, при кипячении гибнет через 1 мин, под действием 5% раствора фенола через 5—10 мин, 5% раствора лизола — через 2—10 минут.

Эпидемиология. Для всех персиний основными хозяевами являются животные, вторичным — человек.

Y. pestis — чума — человеку передается через укусы блох, а также контактным, алиментарным или воздушно-капельными путями.

Эпидемии чумы известны с древнейших времен. Это заболевание приводило к гибели миллионов людей. В XIV— XV вв. пандемия чумы унесла около 60 млн жизней. В 1894 г. в Гонконге началась 3-я пандемия чумы, которая продолжалась 20 лет и унесла 10 млн жизней.

Последние вспышки были зарегистрированы в Индии (90-е гг. XX в.).

Y. Enterocolitica — вызывают у человека инфекции, сопровождающиеся энтеритом, диареей, псевдоаппендицитом. Главный симптом заболевания — гастроэнтерит. Этот возбудитель в природе распространен повсеместно, выделяется от различных животных. Подъем заболеваемости персинио-зами отмечают в осенне-зимний период. Большинство случаев заражения связаны с употреблением недостаточно проваренного мяса свинины.

Y. pseudotuberculosis — вызывает у человека брыжеечный аденит, а у диких и домашних животных системные поражения. Заражение человека происходит от инфицированного животного путем, общим для большинства кишечных инфекций. Природный резервуар возбудителя — домашние животные и птицы, а также олени, грызуны.

Патогенез. Y. pestis внедряется в организм в месте укуса блохи; блохи инфицируются бактериями, питаясь кровью больных животных. При легочной форме бактерии чумы передаются воздушно-капельным путем с мокротой при кашле больного человека. В зависимости от места локализации возбудителя, иммунного статуса организма, вирулентности микроба может наблюдаться кожная, бубонная, кишечная, первично-легочная, вторично-легочная форма чумы.

Y. Enterocolitica — вызывает энтероколит с диареей, лихорадкой и болями в животе. Вирулентность этого возбудителя связана с адгезивными и инвазионными свойствами, а также выделением энтеротоксина, аналогичного термостабильным токсинам Е. coli. Y. Enterocolitica проникают в слизистую оболочку тонкой кишки, там усилен-

но размножаются и попадают в брыжеечные лимфатические узлы.

Клинические проявления. Чума начинается внезапно. Инкубационный период от 2 до 6 дней. Продромальный период отсутствует: появляется озноб, сильная головная боль и головокружение; лицо становится бледным, с синюшным оттенком и выражением страдания (ужаса) — fades pestica. Каждой форме чумы присущи специфические клинические проявления. Наиболее часто, попав в лимфатический узел, возбудитель вызывает в нем серозно-геморрагическое воспаление, при этом формируется болезненный бубон. Кишечная чума проявляется диареей с обильным выделением крови и слизи. Обычно заканчивается летальным исходом.

Иерсинеоз характеризуется диареей с имитацией приступа аппендицита. Иногда кишечная инфекция может трансформироваться в септицемию с поражением внутренних органов, которые возникают через 2 недели от начала болезни.

Y. pseudotuberculosis — вызывает энтероколиты и воспаление брыжеечных лимфатических узлов.

Иммунитет. После перенесения чумы у человека вырабатывается стойкий иммунитет. Древние люди догадывались об этом, и переболевших людей привлекали для ухода за больными и для захоронения трупов.

Иммунитет обусловлен фагоцитарной активностью клеток лимфоидно-макрофагальной системы.

Профилактика

1. Ранняя диагностика чумы.

2. Немедленная изоляция больных, госпитализация и установление карантина.

3. Проведение в очагах тщательной дезинсекции и дератизации.

4. Индивидуальная защита медицинского персонала, профилактическое введение стрептомицина и вакцинация.

5. Выполнение международных конвенций по профилактике

Специфическая профилактика проводится путем введения человеку живой вакцины EV. Ее выпускают в сухом виде, вводят подкожно, внутрикожно, накожно однократно или двукратно. Такой иммунитет сохраняется до года. В зависимости от эпидемиологической обстановки проводится ревакцинация через 6—12 месяцев. В последние годы заболеваемость чумой снизилась, хотя в ранее эндемических районах отмечается некоторая активизация природных очагов.

 

 

 

Билет 14

 

1. Работы Коха, их значение в развитии и становлении мед. м/б

Большое значение для медицинской микробиологии имели открытия немецкого ученого Роберта Коха (1843—1910), который обогатил микробиологию совершенными методами исследования. Им и его учениками в практику лабораторной техники введены плотные питательные среды (картофель, желатин, свернутая сыворотка, МПА), анилиновые красители, иммерсионная система, микрофотографирование. Благодаря усовершенствованию техники и методики микробиологических исследований Р. Кох окончательно установил этиологию сибирской язвы, открыл возбудителя туберкулеза (1882), холеры (1883) и получил из туберкулезных микробактерий туберкулин. Ученый подробно исследовал раневые инфекции и разработал способ выделения в чистой культуре патогенных бактерий.

2. Экспериментальная инфекция: цели, методы воспроиведення, практическое значение

3. Возбудитель холеры

Представители этого семейства — изогнутые палочки, подвижные, температурный оптимум для большинства видов 37°С. Некоторые виды патогенны для беспозвоночных и млекопитающих.

В род Vibrio включены прямые и изогнутые палочки, подвижность обусловлена одним или несколькими жгутиками. Вибрионы распространены в пресных и соленых водоемах. Патогенны для животных и человека. Типовой вид — V. cholerae.

Vibrio cholerae — возбудитель холеры.

Возбудителями холеры являются: биовар классического холерного вибриона, описанного впервые в 1854 г. Ф. Паци-ни и подробно исследованного Р. Кохом в 1883 г., и биовар холерного вибриона Эль-Тор, выделенного из трупов паломников на карантинной станции Эль-Тор в Египте (1906 г.). Эти два биовара являются возбудителями холеры у человека. Существует еще 2 биовара: V. cholerae proteus — вызывает понос у птиц, у людей — гастроэнтерит, и V. cholerae albensis — обнаружен в воде, испражнениях и желчи человека.

Морфологические и культуральные свойства. Холерный вибрион — это изогнутая палочка, в виде запятой, имеет один жгутик, спор и капсул не образуют, грам~. Под влиянием

различных факторов вибрионы подвержены изменчивости. Типичные формы обычно выделяют из патологического материала. Подвижность бактерий определяют методом висячей или раздавленной капли.

Холерный вибрион — быстрорастущий микроорганизм, на пептонной воде, уже через 8 ч после посева виден рост культуры невооруженным глазом.

На твердых средах вибрион образует небольшие круглые, голубоватые в проходящем свете колонии. Колонии маслянистые по консистенции, легко снимаются петлей. На скошенном агаре холерный вибрион образует желтоватый налет. На жидких средах образует равномерное помутнение с нежной пленкой на поверхности. При вьфащивании холерных вибрионов используют питательные среды с рН — 8,3— 9,0.

Ферментативные свойства — сбраживают сахара с образованием кислоты (глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, маннозу, маннит); разжижают свернутую сыворотку, желатин, образуют индол, аммиак, молоко свертывают постоянно. Гемолитическая активность и гемагтлютинируюпще свойства являются нестабильными признаками и учитываются как второстепенные данные в идентификации микробов рода Vibrio.

Антигенная структура. У холерных вибрионов имеются О- и Н-антигены. Н-антиген (жгутиковый) — термолабильный, О-антиген — термостабильный, специфический для всех вибрионов, имеет 5 компонентов: А, В, С, D, Е. А-компо-нент присущ всем холерным вибрионам. Разные сочетания присущи сероварам Огава (АВ), Инаба (АС), Хикоджйма (ABC). По структуре О-антигена выделяют 139 серогрупп, возбудители классической холеры и холеры Эль-Тор объединяют в 01. Холероподобные вибрионы не агглютинируются 01-антисывороткой, их называют неагглютинирующимися или НАГ-вибрионами. Они обнаруживаются у больных и вибрионосителей. Полагают, что НАГи являются следствием изменчивости холерных вибрионов, которые утрачи-

вают не только агглютинабельность, но и другие биологические свойства. НАГи сходны с холерными вибрионами по морфологическим культуральным свойствам, но не обладают общими с ними О- и Н-антигенами.

Резистентность. Очень устойчивы к низким температурам, в воде сохраняются до 5 суток, в почве — до 2 месяцев, в испражнениях до 5 месяцев. Холерный вибрион Эль-Тор обладает большей устойчивостью в окружающей среде, чем классический холерный вибрион.

При действии солнечного света холерные вибрионы погибают через несколько часов. При кипячении гибнут сразу. Также, чувствительны к дезрастворам, особенно к кислотам (внутренняя среда желудка человека является хорошим защитным барьером против холерного вибриона).

Эпидемиология. Холера — это острая кишечная инфекция. Вибрионы передаются от больных и носителей через пищу, воду, мух и грязные руки, что характерно для всех кишечных инфекций. Поскольку существуют скрытые формы течения болезни, выделение возбудителя в окружающую среду обусловливает его постоянную циркуляцию.

Наиболее предрасположены к холере лица, проживающие в неблагоприятных условиях (отсутствие питьевой воды) и не соблюдающие правил личной гигиены. Чаще всего подъем заболеваемости отмечают в летне-осенний сезон.

Патогенез поражений. Микробы проникают через рот в тонкий кишечник. Кислая среда желудка губительно действует на холерный вибрион, но в ряде случаев этот барьер нарушается вследствие действия различных факторов, нейтрализующих или снижающих бактерицидные свойства желудочного сока. Небольшая часть все же достигает тонкой кишки, где щелочная среда является благоприятной для размножения возбудителей. Жгутики холерных вибрионов обеспечивают колонизацию возбудителей в организме. Холерный вибрион вырабатывает токсины: эндотоксин и экзотоксин. Эндотоксин не играет существенной роли в развитии болезни. Под действием экзотоксина (холерогена) в просвет

кишки выделяется изотоническая жидкость, состоящая из Н2О, Cl, Na, К, НСО3. В сутки при разных формах заболевания может секретироваться 10—20—30 литров жидкости, которая обратно не всасывается, что приводит к обезвоживанию организма.

Клинические проявления. Инкубационный период холеры от нескольких часов до 2—3 суток. У большинства инфицированных заболевание протекает бессимптомно либо возможна легкая диарея. При клинически выраженных случаях заболевание характеризуется общим недомоганием, болями в животе, диареей, рвотой. Испражнения имеют характерный вид «рисовый отвар» и «рыбный» запах. В развитии болезни различают несколько форм заболевания:

Степень дегидратации

Форма заболевания

Потеря жидкости к весу тела, в%

легкая

средней тяжести

тяжелая

холерный алгид

В тяжелой форме заболевания у больного начинается гиповалемический шок, что приводит к понижению артериального давления, сердечной недостаточности и нарушению сознания. В IV степени дегидратации резко снижается температура тела до 35—34°С, больные уже находятся без пульса и давления. В этой стадии прекращается понос и рвота, начинается учащенное, резкое дыхание, черты лица заостряются.

Продолжительность этих проявлений зависит от своевременно проведенного лечения. При отсутствии лечения больной может умереть.

После перенесенного заболевания остается непродолжительный иммунитет, возможны случаи повторного заражения.

Профилактика холеры направлена на выполнение санитарно-гигиенических требований и проведение карантин-

ных мероприятий. Для специфической профилактики применяют холерную убитую вакцину и холерную комбинированную вакцину, состоящую из двух компонентов — О-антигена холерного вибриона и холерогена-анатоксина.

Лабораторная диагностика. Материалом для исследования являются испражнения, желчь, рвотные массы, секционный материал, вода, сточные воды, смывы с объектов окружающей среды, пищевые продукты и т. д,

Лучше всего брать патологический материал от больного до начала антибактериальной терапии. Для посева используют жидкие среды обогащения, щелочной МП А, элективные и дифференциально-диагностические среды.

Исследование проводят в несколько этапов.

I этап. Материал засевают в пептонную воду на 6— 8 часов, на щелочной агар или на одну из элективных сред.

II этап. Через 6—8 часов после начала исследования изучают характер роста в пептонной воде, откуда высевают возбудителя на щелочной агар и вторую среду накопления.

III этап. Через 14 часов после начала исследования изучают рост на второй среде накопления, производят высев со второй среды накопления на щелочной агар. С чашек отбирают колонии для дальнейшего исследования и пересевают их на среду Кл игл ера.

IV этап. Через 18—24 часа после начала исследования отбирают подозрительные колонии с применением пробы на индофенолоксидазу (с помощью реагента или индикаторных бумажек). Подозрительные колонии исследуют в реакции агглютинации на стекле с 01-антисывороткой, а также с сыворотками Огава и Инаба.

Из культур готовят мазки для окрашивания по Граму и далее проводят биохимическую идентификацию выросших бактерий.

7. Зак. 361

Правила забора материала от больного холерой

Сбор материала производится в стерильную стеклянную посуду со средой обогащения (щелочная 1 % пептон-ная вода) при помощи ватных тампонов. Исследуемый материал следует брать до назначения АБ, так как через 1—2 часа после их приема количество вибрионов уменьшается, а через 1—3 суток вообще не обнаруживается.

Количество материала зависит от клинических проявлений. При тяжелой форме— 0,1— 0,5мл на 50мл пеп-тонной воды, при легкой — 1—2 г испражнений.

При исследовании на вибриононосительство — предварительно солевое слабительное (чтобы получить жидкие испражнения из верхних отделов кишечника).

В лабораторию материал доставляют не позже, чем через 3 часа от момента забора, положительный ответ можно получить через 18—48 часов.

 

Билет 15

 

1. Основные виды микроскопии м/о, их суть (световая, люмпппецен тная, темнопольная, фазово-
контраетная, электронная), практическое применение