Ведущие методы, в которых не используются животные

Ниже мы рассматриваем доступные в настоящее время не использующие животных методы тестирования различных видов токсичности, и называем исследования, которые нужно провести в первую очередь, для того чтобы как можно скорее заменить эксперименты на животных, создавать и тестировать новые косметические ингредиенты гуманным образом.
При исследовании почти любого вида токсичности химикаты нужно будет тестировать поэтапно или поуровнево. Потому что редко когда можно заменить одноэтапное тестирование на животных одноэтапным альтернативным методом. Наоборот, шаг за шагом применяются несколько различных техник non-animal. Первая ступенька - это, как правило, простой, рентабельный метод, предоставляющий некоторую ограниченную информацию о химикате. Примером может служить анализ физико-химических свойств химиката.
Иногда для того, чтобы идентифицировать и классифицировать явно токсичное вещество, первого уровня было бы достаточно, но чаще химикат должен проходить второй шаг или уровень. Это может быть компьютерный прогноз или простой пробирочный тест на клеточной культуре. Для некоторых химикатов могут потребоваться третий или четвертый уровень с проведением более сложных клеточных испытаний или даже исследований на добровольцах.

Таблица 2. Методы тестирования без использования животных, прошедшие валидацию и одобренные для официального применения в ОЭСР и/или Евросоюзе

Предмет исследования	Метод non-animal	Номер руководства по тестированию ОЭСР и/или ЕС *
Разъедание кожных покровов	Восстановленная человеческая кожа	TG431, B40
Разъедание кожных покровов	TER-метод, использующий изолированные фрагменты кожи	TG430, B40
Абсорбция кожей	Отдельные фрагменты кожи	TG428
Мутагенность/генотоксичность	Тест Эймса с использованием бактерий	TG471, B13/14
Мутагенность/генотоксичность	Мутации генов у дрожжевых грибков	TG480, B15
Мутагенность/генотоксичность	Митотические рекомбинации у дрожжевых грибков	TG481, B16
Мутагенность/генотоксичность	Тест на аберрацию хромосом в клетках млекопитающих (на клеточной культуре)	TG473, B10
Мутагенность/генотоксичность	Тест на мутацию хромосом в клетках млекопитающих (на клеточной культуре)	TG476, B17
Мутагенность/генотоксичность	Внеплановый синтез ДНК (на клеточной культуре)	TG482, B18
Мутагенность/генотоксичность	Обмен сестринских хроматид (на клеточной культуре)	TG479, B19
Светораздражимость (фотосенситизация)	NRU (Neutral Red Uptake) метод (культуры клеток)	TG432, B41
Канцерогенность	Тест на трансформацию клеток у млекопитающего (на клеточной культуре)	B21

 

* Номер 'TG' обозначает руководство ОЭСР. Номер 'B' обозначает руководство Евросоюза (перечисленные в Приложении V к Директиве по опасным веществам 67/548/EEC).
На каждой стадии тестирования применяются более надежные и предиктивные методы, в совокупности дающие более полные и точные результаты, чем предыдущий шаг. При поэтапном или поуровневом подходе, для того чтобы предоставить информацию, требуемую оценщиками безопасности, обычно требуются взаимодополняющие методы, не использующие животных.

Разъедание и раздражение кожных покровов

Пробирочные тесты на разъедание кожных покровов, проводящиеся на отдельных фрагментах кожи или на восстановленной человеческой коже, были утверждены и одобрены Евросоюзом, как показано в Таблице 2. Поскольку разъедание кожи представляет собой крайне токсичное воздействие, это тот случай, когда результатов одиночного пробирочного теста оказывается достаточно.
Поэтому в Евросоюзе едкие вещества не должны более тестироваться на животных. Однако за пределами Евросоюза некоторые страны до сих пор наносят едкие химикаты на кожу кроликам.

Пробирочные тесты на раздражение кожи в настоящее время проходят валидационное исследование, начатое в 2003 году. Экспериментальная фаза должна закончиться в мае 2005 года, и некоторое время спустя будут опубликованы результаты.
Два вида испытаний проводятся на произведенных на коммерческой основе "образцах восстановленной человеческой кожи". Они были названы перспективными еще в первом докладе Constantine and Weir 1990 года¹. Это:
а) Epi-DermTM
б) EPISKINTM
Выживаемость клеток после нанесения химиката измеряется с помощью маркера МТТ. На настоящий момент эти два теста уже хорошо себя зарекомендовали⁴⁷, и ожидается, что очень скоро они будут успешно валидизированы.
Международная группа экспертов-токсикологов уже высказала свой положительный отзыв⁴⁸, отметив, что сочетание пробирочных методов такого рода с этичными исследованиями на людях-добровольцах позволит оценивать химикаты без тестирования на животных. Поэтому успешная валидация метода [a] или [б] позволит окончательно заменить тестирование на животных в этой области.

Сенситизация кожи (аллергическая реакция)

Официально одобренных методов non-animal, с помощью которых можно было бы исследовать химикаты на предмет сенситизации кожи, пока еще нет. Однако наряду сразвивающимися перспективными методами уже существует несколько прочно утвердившихся техник non-animal, которые вкупе друг с другом могли бы обеспечивать необходимую информацию. Например:
а) абсорбция кожей и связывание с белками
Сенситизация кожи имеет место лишь в том случае, если химикат способен проникать в кожу и связываться с белками. Уже существует принятый ОЭСР in vitro тест на поглощение кожей (Таблица 2, выше), а степень связывания с белками можно надежно измерить с помощью пробирочного метода in vitro. Европейская торговая ассоциация COLIPA считает связывание с белками полезным методом, позволяющим компаниям выявить опасность.⁴⁹
Сочетание этих двух методов позволит определить вещества, не вызывающие сенситизацию, и таким образом эти методы составят первый этап в стратегии поэтапного тестирования.
б) компьютерные системы
Существуют компьютерные системы, такие как модель DEREK, которые могут предсказывать кожную сенситизацию, основываясь на знании о химических структурах, способных вызывать аллергические реакции. Они будут проходить валидацию в течение последующих 1-2 лет.
Они составят вторую стадию или второй уровень стратегии поэтапного тестирования, а за ними последуют описанные ниже [c] и [d], для получения более определенных результатов.
в) Испытания на клеточных культурах
Для прогнозирования сенситизации разрабатываются тесты на клеточных культурах^50,51, и L'Oreal провел серьезные исследования в данной области. Европейский центр валидации альтернативных методов (ECVAM) полагает, что с формальной точки зрения валидацию этих методов можно будет завершить в 2006 году, и их можно будет представлять на рассмотрение регламентирующим органам.
г) Исследования на людях-добровольцах
SCCP принимает к рассмотрению результаты исследований сенситизации кожи, проведенных на добровольцах. Хотя SCCP и не рекомендует предпринимать исследования на людях, он все же отмечает, что тестирование на людях имеет определенные преимущества, поскольку таким образом можно избежать межвидовых различий в реакциях.⁵²
В свете всего вышесказанного, несмотря на отсутствие полностью валидизированных и принятых методов non-animal, тестирование многих косметических ингредиентов или продуктов на предмет сенситизации можно проводить без экспериментов на животных уже сегодня; и, определенно, это можно будет делать к 2006 году.

Абсорбция кожей

Важно знать, может ли косметический ингредиент проникать в кожу и достигать кровяного русла. Если нет, тогда тестирование можно ограничить проверкой воздействия на кожу. Если ингредиент все же способен достигать кровяного русла, он может повредить внутренние ткани и органы, поэтому может потребоваться дополнительное тестирование - например, на острую токсичность и токсичность повторных доз.
К счастью, для измерения асборбции кожей кожей существует полностью валидизированный и официально принятый пробирочный метод (см. Таблицу 2 выше). Уже на протяжении нескольких лет SCCP принимает к рассмотрениею данные, полученные с помощью этой техники; он также принимает данные по абсорбции кожей, полученные в исследованиях на людях-добровольцах, которые он считает "идеальными".

Раздражение глаз

Поэтапная стратегия уже рекомендована руководствами для тестирования химикатов на предмет раздражения глаз у человека, использование животных требуется лишь в тех случаях, когда химикат проявил негативное воздействие на стадиях non-animal. Последние включают в себя оценку физико-химических качеств (в том числе с помощью компьютерных методов QSAR) и рассмотрение кислотных/алкалиновых качеств (поскольку крайние показатели обоих могут вызывать раздражение глаз)
Существует четыре прочно утвердившихся метода, использующих отдельные ткани животных и способных выявлять сильные раздражители глаз без использования живых животных. Это тест на курином яйце, тест на бычьей роговице на восприимчивость и проницаемость (использующий ткани коров, полученные с бойни), тест на кроличьем глазе и тест на курином глазе (в обоих тестах используются глаза гуманно умерщвленных животных).
Некоторые из этих тестов были официально одобрены на национальном уровне, например в Германии, Бельгии, Британии и Нидерландах. Во Франции все четыре теста приняты для выявления веществ с сильным раздражающим действием на глаза, а также используют методы на культурах клеток NRU и диффузии в агаровой среде для оценки косметической продукции.^{53, 54}
Однако на международном уровне согласие относительно того, какие методы наилучшим образом позволяют отличать не раздражающие вещества от мягких и средних раздражителей, еще не достигнуто. Главные кандидаты на эту роль следующие:
а) EpiOcular (модель эпителиального слоя роговицы, созданная на основе культуры клеток роговицы человека). Этот тест хорошо себя проявил в двух исследованиях косметических и парфюмерных ингредиентов. Его следует быстро представить на валидацию.
б) Метод распространения флуоресценции (модель на основе культуры клеток почки собаки). Считается, что этот анализ может прогнозировать повреждение и восстановление роговицы. Он хорошо себя показал в тестировании продукции для волос, особенно в различении мягких и средних раздражителей.58 Требуются дальнейшая разработка и последующая валидация.
в) Метод NRU (выявляет степень повреждения мембраны клеток) проводится с использованием человеческих эпителиальных клеток, а также клеток мышей и кроликов. Человеческие клетки явно предпочтительнее. Constantine and Weir финансировали разработку теста, основанного на том же принципе, в начале 1990-х годов.⁵⁹ ECVAM рассмотрел этот тест и заключил, что, если компании будут применять его в сочетании с другими пробирочными методами для своих внутренних целей, "результаты, получаемые с помощью NRU определенно более релевантны и обеспечивают более надежную защиту от потенциальной угрозы, чем общепринятый тест Драйза".⁶⁰
Для оценки различных видов химикатов⁶¹ и различных степеней раздражающей способности (например: слабая, средняя, сильная) может потребоваться сочетание нескольких тестов. Следующими шагами должны стать модификация ведущих тестов с целью их улучшения и получение от компаний наиболее надежных данных по исследованиям, проводившимся на живых животных. В противовес этим исследованиям можно будет валидизировать новые тесты.

Острая токсичность

SCCP обычно не требует проведения испытаний на животных специально для получения данных по острой токсичности, но ожидает, что, если такая информация существует, она будет представлена. В отношении многих косметических ингредиентов такие данные уже будут доступны, особенно если химикат уже одобрен в соответствии с Директивами по опасным веществам.
Евросоюз участвует в финансировании нового проекта под названием A-Cute-Tox. Целью проекта является создание простой, надежной стратегии пробирочного тестирования, позволяющей прогнозировать острую токсичность для людей и заменить официально принятые на сегодняшний день испытания на животных.
Для выявления острой токсичности без использования животных требуется комбинация нескольких тестов. Результаты пробирочных тестов на абсорбцию через кожу и пищеварительный канал (см. [8] ниже) показывают, будет ли химикат всасываться через кожу или пищеварительный тракт.
Если имеет место значительная абсорбция, можно провести следующие испытания:
а) компьютерные методы QSAR
Они составляют первый шаг в стратегии тестирования non-animal на предмет острой токсичности. Как было сказано в недавнем подробном обзоре⁶²: "Модели QSAR можно было бы использовать в приоретизации химикатов для дальнейшего тестирования, идентификации определенных видов токсической угрозы или для оценки токсического потенциала с целью определения степени риска".
Существует несколько пакетов программного обеспечения. Ведущий пример - это TOPKAT Model Rat Oral LD50, разработанный с применением показателей, полученных экспериментальным путем с помощью LD50, примерно по 4 000 химикатов. Также существует TOPKAT Model for Rat Inhalation LC50^63. Пакеты TOPKAT применяются различными регламентирующими органами в Европе.⁶⁴ Например, Датское агентство по защите окружающей проверило с помощью QSAR 47 000 химикатов и идентифицировало 9 538 химикатов как вероятно остро токсичные при попадании в пищеварительный тракт.⁶⁵
б) тесты на клеточных культурах
Программа многофакторной оценки цитотоксичности in vitro (The Multicentre Evaluation of In vitro Cytotoxicity (MEIC) programme) показала, что сочетание четырех тестов на культурах человеческих клеток⁶⁶ может быть практичным, быстрым, эффективным с точки зрения расходов и высоко предиктивным в оценке токсичности для человека. Эти пробирочные методы прошли предварительную валидацию и могли бы стать быстрым и информативным способом идентификации химикатов на каждом конце спектра, то есть высокотоксичных или нетоксичных.
К тому же почти завершена валидация двух других клеточных методов проверки на острую токсичность. Это тесты NRU с использованием клеток кератиноцитов человека (BALB/c 3T3 фибробласты), уже широко применяемые в нерегуляторных целях. Вскоре должна завершиться заключительная стадия валидации. Важно то, что уже в 2002 году ECVAM считал, что эти тесты можно незамедлительно использовать для быстрой проверки большого количества химикатов и выявления тех из них, которые требуют дальнейшей оценки.⁶⁷
Таким образом, уже существует несколько тестов на цитотоксичность, позволяющих быстро идентифицировать химикаты, представляющие собой значительную угрозу в плане острой токсичности.
в) исследования токсикокинетики и метаболизма с применением компьютерных моделей и пробирочных методов (см. [8] ниже), предоставляют необходимые данные о том, каким образом химикат всасывается, распределяется, метаболируется и выводится из организма. Эта информация необходима для интерпретации результатов тестов [a] и [б] в отношении всего организма.
г) концентрацию и объемы распределения химикатов в тканях организма можно предсказать посредством пробирочного разложения тканей крови, с применением давно себя зарекомендовавших техник, знакомых промышленным лабораториям.
д) исследования органов-мишеней на предмет избирательного воздействия химикатов на такие органы как почки, мозг, сосудистые клетки или сердце можно проводить in vitro, хотя некоторые техники требуют валидации. Однако Международный симпозиум по in vitro, которые применяются для оценки острой системной токсичности, указал, что, вероятно, нет необходимости проводить в плановом порядке in vitro проверки на воздействие на каждый конкретный орган.⁶⁸
Для тех косметических ингредиентов, по которым нет данных по острой токсичности, можно поэтапно выполнить шаги от [a] до [г], хотя на практике некоторые химикаты можно классифицировать по прохождении всего лишь двух или трех шагов.

Токсичность повторных доз

SCCP устанавливает⁶⁹, что новые косметические ингредиенты следует тестировать на субхрониченскую токсичность на животных, если эти ингредиенты пользуются льготами в соответствии с Директивами по опасным веществам (например, если химикат производится в малых количествах).
Тесты на субхроническую токсичность подразумевают ежедневное введение дозы в течение 28 или 90 дней (см.главу 4). Однако если вещество не проникает в кожу, и если нет вероятности проглатывания или попадания в кровяное русло, такое тестирование представляется излишним. Оба эти качества могут быть оценены без использования животных (см. [5], выше).
Методы тестирования токсичности повторных доз без использования животных еще не полностью разработаны или валидизированы, но исследования показывают, что это достижимо. Промедления отражают недостаток исследовательских усилий и инвестиций, а не непреодолимые технические трудности.
Ускорение должен обеспечить новый исследовательский проект, осуществляемый при поддержке ЕС, под названием REDICTOMICS, целью которого является разработка краткосрочных in vitro исследований для прогнозирования долгосрочной токсичности.⁷⁰
Еще одна цель, которую ставит перед собой проект - это выявление при помощи геномного и протеомического анализа⁷¹ ранних маркеров вызванного токсинами повреждения клеток, а также идентификация и предварительная валидация клеточных систем, способных прогнозировать вызванные токсинами хронические повреждения почек и печени. Эти смелые интегрированные подходы обещают совершить революцию в тестировании химикатов.
До валидизации методов, не использующих животных, следует ввести мораторий на введение новых косметических ингредиентов. Компании могут продолжать вводить новшества, разрабатывая новые комбинации химикатов из существующего списка, состоящего из более чем 8 000 ингредиентов. Изыскания, необходимые для создания методов тестирования токсичности повторных доз без использования животных, должны стать приоритетными, так, чтобы компании, в случае надобности, могли бы должным образом внедрять новые, безопасные ингредиенты.