Малая рибосомная субъединица –главный исполнитель в сценарии инициации

Конкретные генетические функции малой рибосомной субъединицы в ходе инициации трансляции могут быть разделены на три группы процессов с участием - мРНК. Во-первых, малая рибосомная субъединица, связывая мРНК, служит первичным акцептором генетической информации для белоксинтезирующего аппарата. Во-вторых, она с участием факторов инициации обеспечивает узнавание инициирующего участка на иРНК путем непосредственного узнавания его структуры и присоединения [у прокариот], или путем сканирования цепи мРНК [у эукариот]. И, в-третьих, малая рибосомная субъединица обеспечивает кодон-антикодоновое взаимодействие инициирующего кодона иРНК с антикодоном инициирующей тРНК. Малая рибосомная субъединица таким образом, является главным " действующим лицом " всего сценария инициации.

Большая рибосомная субчастица включается в процесс на завершающем этапе процесса инициации и в соответствии с указанным выше " разделением труда " исполняет биохимическую часть функций. Она индуцирует гидролиз ГТФ на факторе инициации IF2, вытесняет все факторы инициации с малой рибосомной субчастицы, надлежащим образом устанавливает субстраты - инициаторную метионил-тРНК и связывающуюся с А-участком аминоацил-тРНК - в своем пептидилтрансферазном центре и, наконец, катализирует реакцию транспептидации между субстратами. Итак, после включения механизма инициация Рис.10-10. Схема реакций фазы терминации в мезанизме трансляции. трансляции, рибосома обеспечивает прочный комплементарный контакт связанных с ней

молекул аминоацил-тРНК – инициирущий метионил-тРНК в Р-участке рибосомы и аминоацил-тРНК на А участке с двумя смежными триплетами (кодонами) иРНК. Это исходное состояние для начала реакции транспептидации между этими двумя аминоацил-тРНК, которая обеспечивает образование дипептидил-тРНК, связанной с кодоном в А-участке рибосомы. Для этого аминокислота, связанная с тРНК на Р участке отделяется от тРНК и переносится на свободную аминогруппу аминокислоты, расположенной на А- участке с образованием пептидной связи. Эта реакция не требует затраты энергии. Пептидил трансферазную активность связывают с23S рРНК, которую причисляют к числу рибозимов - РНК, обладающих каталитической активностью. Затем происходит процесс транслокации, при котором остаток тРНК связанный с дипептидом перемещается из А-участка в Р-участок. Для этого цепь иРНК протаскивается относительно рибосомы ровно на один триплет нуклеотидов, и теперь в А-участке устанавливается смежный с предыдущим триплет нуклеотидов, а на Е участке оказывается свободная тРНК, которая вытесняется с рибосомного комплекса. В процессе транслокации участвует фактор элонгации EF-G, обладающий ГТФазной активностью. Последующие события элонгации происходят таким же способом: 1) аминоацил-тРНК, комплементарная вновь установленному в А-участке кодону в сопровождении фактора элонгации с ГТФ, связывается с этим кодоном в А-участке 2) дипептидил-тРНК Р-участка реагирует с новой аминоацил-тРНК на А-участке путем транспептидации, что приводит к образованию трипептидил-тРНК в А-участке, и 3) транслокация перебрасывает остаток тРНК молекулы трипептидил-тРНК из А-участка на Р-участок. За этим шагом следует аналогичный ряд событий (1-3), начинающийся с комплементарного связывания очередной аминоацил-тРНК с новым кодоном на А-участке.

Таким образом, благодаря триплет-триплетному связыванию (кодон-антикодоновому взаимодействию) между мРНК и тРНК в рибосоме, транслокация тРНК каждый раз приводит к протягиванию цепи мРНК относительно рибосомы ровно на три нуклеотида. Рибосома перемещает тРНК однонаправленно из А-участка на Р-участок, перемещение цепи иРНК оказывается тоже однонаправленным. В процессе элонгации оно может происходить только в направлении от 5'- к 3'-концу цепи. В целом получается, что при элонгации рибосома работает как лентопротяжный механизм, перемещая с помощью тРНК цепь мРНК относительно себя с шагом по три нуклеотида. Важно отметить, что в процессе этого перемещения рибосома расплетает все попадающиеся на ее пути двуспиральные участки и более сложные элементы вторичной и третичной структуры мРНК.
У прокариот (бактерий) ДНК не отделена мембраной от цитоплазмы и рибосом, и трансляция начинается на цепях иРНК во время ее синтеза на ДНК. Следует отметить четкую временную слаженность этих двух процессов. Молекулы РНК-полимеразы синтезируют цепи иРНК, начиная от 5'-конца РНК в направлении к 3'-концу, а рибосомы присоединяются к 5'-концевым участкам иРНК, инициируют трансляцию и двигаются в процессе элонгации по направлению к молекуле полимеразы.Такое явление получило название сопряженной транскрипции-трансляции. В бактериальных клетках скорость синтеза РНК (транскрипции) - около 30-45 нуклеотидов в секунду при 37⁰С, а скорость трансляции - около 10-15 триплетов в секунду, т.е. один триплет нуклеотидов синтезируется приблизительно за то же время, за которое он прочитывается и образуется одна пептидная связь. У эукариот сопряжение транскрипции и трансляции невозможно. ДНК (хромосомы) эукариот отделены от цитоплазмы, содержащей рибосомы, ядерной мембраной. Поэтому иРНК у эукариот синтезируется полностью в клеточном ядре и затем транспортируется в цитозоль, где и встречается с рибосомами. Для инициации трансляции иРНК эукариот требуется не только 5'-конец мРНК, но и готовая 3'-концевая часть, являющаяся "усилителем" инициации. В отличие от бактерий скорость элонгации у эукариот варьирует в широких пределах, обычно от 1 до 10 триплетов в секунду, в зависимости от типа клеток, их физиологического состояния и природы транслируемой мРНК

Постепенно перемещаясь по иРНК и удлиняя полипептидную цепь, транслирующая рибосома доходит до конца кодирующей последовательности и встречается с одним из трех триплетов, не кодирующих аминокислоты и обозначаемых как терминирующие или стоп-кодоны - УАГ, УАА или УГА (их называли также незначащими, или бессмысленными, кодонами). После заключительной транслокации пептидил тРНК на Р-участок рибосомы, на А-участке устанавливается терминирующий кодон и в дело вступают специальные белки, называемые факторами терминации, или факторами освобождения (release factors, RF). Один из них, RF1 (или похожий на него RF2), взаимодействует непосредственно с кодоном терминации в А-участке, а другой, RF3, при содействии первого и с участием ГТФ - с большой субъединицей рибосомы и, возможно, непосредственно с пептидилтрансферазным центром. Результатом связывания этих факторов с рибосомой является активирование гидролазной активности пептидилтрансферазного центра рибосомы, катализирующего реакцию взаимодействия полипептидил-тРНК (донорный субстрат) с молекулой воды (акцепторным субстратом):

Связь между синтезированным полипептидом (его С-концом) и тРНК гидролизуется и полипептид покидает рибосому.

Заключительным актом терминации является выход деацилированной тРНК из Р-участка и диссоциация рибосомы на субчастицы. Диссоциация происходит спонтанно вследствие ослабления связи между двумя рибосомными субчастицами в отсутствие лигандов (пептидил-тРНК и аминоацил-тРНК), и у бактерий может значительно ускоряться под действием специального белка, называемого фактором освобождения рибосом.

После диссоциации терминировавшей рибосомы на субчастицы малая субчастица не обязательно покидает иРНК: она может задержаться на ней и в случае полицистронных мРНК у прокариот проскользнуть по цепи мРНК до начала следующей кодирующей последовательности и инициировать новую трансляцию (реинициация). Так как малая субчастица до инициации слабо удерживается на иРНК, то, если ей нечего реинициировать на этой же цепи мРНК, она скоро соскочит с нее и окажется среди пула свободных субчастиц цитоплазмы, готовых к инициации трансляции других иРНК.

Во время элонгации происходит и еще одно важное событие, оказывающее существенное влияние на будущую жизнь молекулы. Это формирование пространственной структуры

Поскольку в процессе элонгации новый аминокислотный остаток добавляется к С-концевой аминокислоте пептида, то по мере синтеза N-конец пептида все более отодвигается от пептидилтрансферазного центра рибосомы. На рибосоме может разместиться не более 10-30 аминокислотных остатков растущего полипептида, а полипептидные цепи синтезируемых рибосомой белков состоят из 100-300 аминокилот. Это значит, что через какое-то время после начала трансляции N-концевая часть растущего полипептида оказывается вне рибосомы и затем по мере роста полипептида все большая часть его свешивается с рибосомы в окружающую среду. В ней полипептидная цепь не может оставаться в виде развернутой цепи: ее гидрофобные боковые группы взаимодействуют друг с другом, а гидрофильные - с окружающей водой и ионами. Это создает условия для сворачивания, компактизации и самоорганизации внерибосомной части растущего полипептида в пространственную (вторичную и третичную) структуру. Сворачивание полипептида в компактную структуру происходит, таким образом, полярно, от N-конца к С-концу. Такое постепенное полярное сворачивание растущей полипептидной цепи на рибосоме обозначается как котрансляционное формирование структуры белка. В других случаях белок, синтезируемый рибосомой и используемый в других компартментах клетки необходимо перенести через мембрану либо вне клетки, либо в одну из внутриклеточных органелл. Транспорт такого белка через мембрану требует несвернутого состояния его полипептидной цепи. В этом случае могут быть использованы две альтернативные возможности: 1) рибосомы, синтезирующие белок, предназначенный для транспорта через мембрану, сами сидят на мембране (мембраносвязанные рибосомы), и растущий полипептид в развернутом виде поступает из них непосредственно в мембрану; 2) свободные (не прикрепленные к мембране) рибосомы цитоплазмы синтезируют полипептидную цепь, которая по мере выхода из рибосомы взаимодействует со специальными белками - молекулярными чаперонами. Чапероны препятствуют полному сворачиванию белка в компактную структуру и поддерживают его недосвернутое состояние в растворе. После освобождения из рибосомы эти недосвернутые белки взаимодействуют с мембраной и транспортируются через нее. Поддержание недосвернутого состояния белков чаперонами может требоваться также и для интеграции этих белков в надмолекулярные структуры клетки, для сборки четвертичных структур сложных белков, для вступления в комплексы с некоторыми лигандами и т.п. В этих случаях белки формируют свои пространственные структуры в составе указанных структур и комплексов. Об этом подробнее в следующем разделе.

Ингибиторы синтеза белков

Многие антибиотики, используемые для лечения бактериальных инфекций также как и некоторые токсины действуют путем ингибирования трансляции. Ингибирование может быть произведено на всех стадиях трансляции от инициации элонгации к терминации.

 

Некоторые Антибиотики и токсины - ингибиторы трансляции
Ингибитор	Действие
Хлорамфеникол	Ингибирует пептидилтрансферазу на большой субъединице рибосом прокариот
Циклогексимид	Ингибирует пептидилтрансферазу на большой субъединице рибосом эукариот
Эритромицин	Ингибирует транслокацию прокариотическими большими субъединицами
Фузидиновая кислота	Ингибирует элонгацию у прокариот путем связывания EF-G GDP, предотвращая диссоциацию его от большой субъединицы
Пуромицин	Аналог аминоацил-тРНК, вызывает преждевременную терминацию у прокариот и эукариот
Стрептомицин	Ингибирует инициацию роста пептидной цепи, способствует неправильному считыванию иРНК, у прокариот
Тетрациклин	Ингибирует связывание аминоацил тРНК к прокариотической малой субъединице
Дифтерийный токсин	Ингибирует связывание аминоацил - т-РНК к прокариотической маленькой субъединице Каталитически инактивирует eEF-2 путем АДФ- рибозилирования
Рицин	Смертельный растительный лектин. Найден в касторовом семени, катализирует распад рРНК большой субъединицы рибосом эукариот