Техника спектроскопических методов.

Из-за большой сложности спектров молекул, которые, строго говоря, простираются от УФ до микроволновой области, используется различная техника. Спектроскопические области, лежащие в различных интервалах, получили собственное название. Спектры поглощения лежащие в УФ и видимой области исследуются электронной спектроскопией или спектрофотометрией. Название обусловлено тем, что определенная роль в этих спектрах играют переходы между различными электронными уровнями молекулы.

S2

Спектры поглощения, обусловленные переходом между колебательными уровнями, исследуются колебательной или ИК спектроскопией. Эти спектры лежат в ИК области.

Спектры поглощения, обусловленные переходами между вращательными уровнями - микроволновая спектроскопия.

Принципиально схемы спектрофотометров УФ, ИК и микроволновыми спектроскопами не отличаются. В каждом устройстве есть источник света, дающий излучение в нужной спектральной области, затем есть монохроматор (т.е. прибор, который разлагает излучение в спектр). Иногда вместо монохроматора используют набор светофильтров, пропускающих свет в разных диапазонах, затем есть кювета с исследуемым веществом и прибор регистрирующий интенсивность падающего на него света. Сигнал с этого прибора выводится либо на экран компьютера, либо на самописец. Разница заключается в источниках света и монохроматорах - они различны для видимой, ИК и микроволновой областей.

Оптическая схема спектрофотометра и спктрофлуориметра:

1- Источник излучения

2- Устройство отсечки второго порядка дифракции

3- Монохроматор канала возбуждения

4- и 7 Светофильтры каналов возбуждения и регистрации люминесценции

.6-Кювета с анализируемым образцом

.8-Монохроматор флуориметрического канала

.9-Фотоприемник флуориметрического канала (ФЭУ)

10 и 5- Светоделительные пластины

11- Фотоприемник канала пропускания (фотометрического)

12- Фотоприемник опорного канала

 

1 2

 

 

5 12

 

 

 

 

 

9

10 11

 

 

Спектральные характеристики:

1- Спектральный диапазон в канале возбуждения 210-840 нм

2- Спектральный диапазон в канале пропускания 210-840 нм

3- Спектральный диапазон люминесценции 210-690 нм

4- Спектральное разрешение монохроматоров для спектральных применений рекомендуется не более 8 нм, для хромотографических – не более 15 нм

5- Погрешность установки монохроматоров не более 3 нм

6- Отношение сигнал/излучение 100:1 – для приборов с разрешением 8 нм и 200:1 для 15 нм

Что такое спектр? Это представленное графически зависимость коэффициента поглощения на этой длине волны.

x

10^4

10^8

E(x)

 

 

Чтобы получить спектр поглощения, нужно иметь источник света со сплошным светом:

1. Лампы накаливания
2. Газоразрядные лампы (например, ксеноновые, водородные, дейтериевые)

Нарисуем спектр излучения ксеноновой лампы.

I(λ)

 

 

Λ(нм)

 

 

Спектр Хе лампы очень близок к спектру солнечного излучения. Излучение ксеноновой лампы 1 переходит через светофильтр 2, который не пропускает длинноволновое ИК излучение. Иногда, в зависимости от области работы прибора, этот фильтр не пропускает какую-то часть УФ или видимого излучения лампы.

Затем в монохроматоре 3, обычно с помощью дифракционной решетки, излучение лампы разлагается в спектр.

Излучение определенной длинны волны через светофильтр 4, который не пропускает ненужное излучение, уже монохромный свет проходит через делительную пластинку 5 и попадает на кюветное отделение 6. Проходя через образец, излучение поглощается, и поэтому на выходе ослабленное поглощением вещества излучение отражается делительной пластинкой и попадает на фотоприемник спектрофотометра. Фотоприемник измеряет интенсивность этого излучения и передает сигнал в систему регистрации. Система регистрации (не указана на рисунке), производит сравнение величины сигнала, прошедшего через образец, и величины сигнала, попадающего на образец. Отношение этих величин и дает нам величину поглощения образца на данной длине волны. Затем, вращением ручки монохроматора (вручную или автоматически) на образец направляется излучение с другой длиной волны, и все процедуры повторяются. Величина интенсивности, падающего на образец излучения берется с фотоприемника опорного канала12.

Опорный канал II нужен для того, чтобы учитывать интенсивность падающего на образец света (у Хе лампы интенсивность излучения на λ=250 нм отличается от λ=350 нм приблизительно в 15 раз).

Эта схема однолучевого спектрофотометра. Если анализируемый образец является раствором нескольких соединении или если растворитель сильно поглощает, то тогда для определения спектра поглощения интересующего количества вещества используется двухлучевой спектрофотометр.

В этом случае после монохроматора излучение разделяется на 2 пучка (2 потока).

		канал сравнения
			Спектр поглощения измеряемого вещества

 

Регистрация сравнения

монохроматор

S

			Регистрация излучения

 

	канал измерения

 

 

1. Светоделительная полупрозрачная пластинка
2. 100% зеркало

Вычитание из измеренного сигнала сравнительного сигнала.

Обычно в видимой и УФ области в качестве фотоприемника (прибора, регистрирующего интенсивность падающего на него света) используются.

ФЭХ. Фотоэлектронные умножители.

5U1

3U1

U1

ФЭХ представляют собой ваккуумированную трубку, внутри которой располагаются до 10 электродов.

		2U1		4U1
				6U1

 

Для работы в УФ и видимой области используют кварцевые пластинки внутри ФЭХ называемые динодами. Первая пластинка, на которую падает свет – ФД-фотодинод.

Излучение падает на ФД, который покрыт веществом с маленькими потенциалами ионизации. Поэтому, за счет фотоэффекта из AL выбиваются электроны. Между AL и ближайшим динодом приложена ускоряющая электроны разность потенциалов U₁. Поэтому электроны ускоряются и ударяются в первый динод с большой кинетической энергией. Все остальные D кроме ФД покрыты веществом с малой работой выхода электронов, поэтому при ударе электронов с ID, из него выбиваются дополнительные электроны, которые ускоряются разностью потенциалов. 2U₁, приложенная между I и II.

Поэтому на последний D приходит лавина электронов, которая и считается усиливающей системой как импульс тока. Таким образом, в зависимости I света, падающего на динод, с ФЭХ снимается электрический сигнал, величина которого пропорциональна I падающего света – фотоэлекроумножитель.

Источники света.

Наиболее удобным источником света для цели спектрофотометрии и спектрофлуориметрии (люминесцентной), является ксеноновая лампа, которая обладает сплошным спектром в широкой области спектра и большой интенсивностью. Излучение света происходит в ней за счет электрического разряда в ксеноне.

 

 

 

+

Поджиг

-

 

 

Давление Xe в лампе бывает различным, но всегда высокое – достигает нескольких атмосфер, поэтому хранят Xe лампы в специальных кожухах. Излучение происходит после возникновения пробоя между А и К, который инициируется высокочастотным разрядом. Затем летящие с большой скоростью электроны попадают в атомы Xe и возбуждают их. Возвращаясь в основное состояние, атомы Xe испускают излучение. Так как электроны обладают широким спектром кинетических энергий, то в атомах Xe возбуждается почти все электронные уровни, и поэтому спектр излучения широкий. Анод делается массивным, обычно из титана, поэтому он нагревается при бомбардировке электронами и излучает ИК излучение. Интенсивность этого излучения достаточно велика, и поэтому это ИК тепловое из общего спектра необходимо удалять. Это делается обычно при использовании мощных ламп с помощью фильтров, избирательно поглощающих ИК излучение. Самым простым и удобным фильтром является обычная вода. Из-за высокой температуры во время работы лампы и испарения ее электродов срок ее работы обычно не превышает 200-300 часов. Для люминесцентных исследований иногда используются также разрядные лампы, дающие не сплошной, а дискретный спектр. Наиболее распространенным источником мощного, но дискретного излучения является ртутная лампа.

Технически ртутные лампы изготавливаются различных форм. Для целей спектроскопических обычно ртутные лампы делаются такие же, как Xe лампы. Отличия – ртутные лампы работают на переменном токе, и поэтому у нее нет А и К, а есть электроды разного размера.

Ртутные лампы в отличие от Xe, заполнены парами ртути при невысоком давлении. Начало работы также обеспечивается высокочастотным поджигом, разрядом.

Примером ртутной лампы являются обычные люминесцентные лампы. Низковольтный разряд в таких лампах обеспечивается специальными стартерами. В таких лампах атомы Hg излучают только одну резонансную линию.

Λ_рез=253,7 нм

Поверхность люминесцентных ламп покрыта люминофором. Люминофор – это вещество, которое после подвода к нему энергии в каком-либо виде (облучение светом, бомбардировка электронами или ионами) испускает излучение в определенном диапазоне длин волн. У бытовых Hg ламп люминофор излучает от 400 до 800 нм. Однако есть специальные лампы с определенными люминофорами для определенных целей.

Лазеры.

Лазеры как источники мощного и высоко монохроматичного света используется в методах спектрофотометрии, люминесценции, комбинационного рассеяния. Их недостаток – монохроматичность, а преимущество – высокая интенсивность. Для исследования спектров люминесценции в разных диапазонах длин волн возбуждения были созданы лазеры на кристаллах с перестраиваемой длиной волны излучения.

Люминесценция.

Схема спектрофлуориметра, т.е. прибора для регистрации спектров люминесценции приведена на рисунке 1. Излучение определенной длины волны падает на образец, он начинает люминесцировать. Интенсивность люминесценции образца на каждой длине волны делится на интенсивность у возбуждающего света на этой длине волны, получаемого из опорного пучка II. Таким образом, мы регистрируем спектр истинной люминисценции образца, которая не зависит по определению от различия интенсивности возбуждающего излучения. В современных спектрофлуориметрах (и спектрофотометрах) вводятся поправки на изменение чувствительности регистрирующей системы в различных спектральных областях, т.е. учитывается аппаратная функция прибора.

Люминесцентный анализ позволяет по наличию люминесценции, размещению, форме и интенсивности полос ее спектра, а также времени жизни (затухания) судить о физических свойствах излучающего объекта, а также свойствах и составе окружения.

Преимущество – этот метод, как и все остальные методы является не разрушаюшим, селективным, высокочувствительным (люминесцентный метод – чувствительность до 10^-7 моль) и быстрым.

Различают следующие применения фотолюминисцентных методов:

Многие биологически важные соединения люминесцируют. Кроме собственной люминесценции биологических соединений широко используется внедрение в исследуемые биологические системы экзогенных люминофоров. К таким веществам относятся родамин, флуоресцин, мезопорфин (и другие порфирины), хлорофилл А, антрацен, циамины. Благодаря в основном флуоресцентной спектроскопии были развиты современные представления о структуре и функциях липопротеинов, альбуминов, клеток крови и биологических мембран.

Для исследования нелюминесцирующих биологических объектов используются люминесцентные маркеры. Они бывают двух сортов – люминесцентные метки и люминесцентные зонды. Люминесцентная метка – это люминесцирующая молекула вещества, которое химически привязывается к исследуемой молекуле и запускается в организм. По люминесценции этой метки определяют распространение исследуемого вещества в организме или клетке, или в каком-то органе.

Люминесцентные зонды либо индивидуальны, либо пришиваются к каким-то молекулам и запускаются в организм, орган, клетку. Люминесцентным зондом выбираются такие молекулы, свойства люминесценции которых (размещение, структура и интенсивность спектра, время жизни) зависит от свойств окружения. Поэтому по изменению люминесценции зонда можно судить о свойствах той среды, куда была доставлена молекула-носитель зонда или сам зонд.

Некоторые зонды постоянно люминесцируют, некоторые начинают люминесцировать только в комплексе с определенными соединениями.