Определение концентрации спермиев в сперме

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЭК - М

Готовится 3,5%-ный р-р цитрата Na на дистиллированной Н₂0, фильтруется через бумажный фильтр. Разливается в чисто вымытые пенициллиновые флаконы по 9,9 мл в каждый.

Микропипеткой набирают 0,1 спермы и вносят в один из флаконов, промыв несколько раз пипетку из этого же флакона. Таким образом, сперма разбавлена в 100 раз.

Берут кювету ФЭК с рабочей длиной 10 мм и выливают в нее содержимое флакона до метки. В две такие же кюветы наливают чистый р-р 3,5%-ного цитрата. Кювету с разбавленной спермой ставят в правое гнездо прибора на расстояние наиболее удаленное от фотоэлемента. В левое гнездо ставят кювету с чистым р-ром цитрата. Шкалу отсчета оптической плотности левого барабана ставят на ноль и, вращая фотометрические клинья, переводят на ноль стрелку гальванометра вначале грубой настройкой регулятора 1, а затем точной - регулятором 2. Затем кювету со спермой из правого гнезда вынимают, а на ее место ставят кювету с раствором цитрата натрия. Стрелка гальванометра при этом отклоняется и ее ставят на 0, поворачивая левый барабан. На красной шкале барабана читают показатель оптической мутности. Каждые 0,05 деления шкалы соответствуют концентрации 100 млн спермиев в 1 мл неразбавленной спермы. Для определения используется красный фильтр №8.

ПОДСЧЕТ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ФОРМ СПЕРМИЕВ /ТЕРАТОСПЕРМИЯ/

Микроскопическое исследование окрашенных мазков спермы показывает, что в эякуляте всегда находится определенное количество патологических форм спермиев - изолированные головки, хвостики, спермин с 2-3 головками, с двумя хвостиками, искривленными хвостиками, слишком большой головкой, с протоплазматической капелькой. Причин этих уродств много, и часто мы их не знаем. Конкретно можно говорить, например, о гигантских и карликовых спермиях при поражении семенника. Большое значение в образовании патологических форм спермиев придается нарушению терморегулирующей функции мошонки (чесотка, экзема, обморожения и т.п.), а также недостаткам кормления, авитоминозам. Иногда встречаются спермин с так называемой протоплазматической капелькой в области шейки, хвоста или кончика его. Считается, что наличие такой капельки говорит о незрелости спермиев. Ныне ряд авторов оспаривает это мнение, но мы будем придерживаться взгляда, что протоплазматическая капелька - признак незрелости спермиев. Очень возможно, что здесь играют роль видовые и индивидуальные особенности животных.

Быки, дающие сперму с содержанием более 18%, бараны свыше 14%, хряки и жеребцы - свыше 20% патологических спермиев считаются бесплодными.

Порядок работы.

Подсчет патологических форм производится поэтапно:

1. Разбавление спермы.

2. Приготовление мазка.

3. Окраска мазка.

4. Микроскопирование и подсчет спермиев.

Свежеполученную сперму быка для уменьшения концентрации спермиев и удобства их подсчета в мазке разбавляем 1%-ным р-ром NaCl в 10-15 раз, а иногда и в 20 раз. Для этого в пенициллиновый флакон вносим сперму в объеме глазной пипетки, а затем туда же добавляем 10-15 пипеток р-ра NaCl. (Для сведения - сперму барана разбавляют в 20-30 раз, а хряка и жеребца в 2-3 раза или совсем не разбавляют).

Затем на чистое предметное стекло делается мазок из спермы (как при гематологическом исследовании) или методом стекающей капли. Опыт показывает, что приготовление мазка гематологическим методом, но нешлифованным стеклом, сильно травмирует спермиев механически. Поэтому лучше делать мазок методом стекающей капли (большая капля р-ра на один конец стекла, наклон его под углом 40-50°, чтобы капля стекала по всему стеклу до другого конца, но здесь под палец положить фильтр, бумагу, чтобы излишек впитался).

После приготовления мазок 5 минут высушивается на воздухе, но не на спиртовке, т.к. иначе будет деформация спермиев. Потом мазок зафиксировать, капнув на него глазной пипеткой 96%-ным спиртом-ректификатом или опустив на 1-2 мин. в стаканчик с 96%-ным спиртом. Затем мазок промывают, чтобы потом окрасить. Однако практика показала, что фиксация перед окраской необязательна. Можно окрашивать и высушенный мазок.

Окраску мазков можно производить фуксином Пфейфера, 0,1%-ным р-ром эозина и др.

Чтобы более равномерно окрасить мазок, накроем его фильтровальной бумагой, на которую обильно капаем краситель с помощью глазной пипетки. Окраска продолжается 5 минут. Затем снимаем фильтр, бумагу, промоем мазок дистиллированной или кипяченой водой и высушим его на воздухе, поставив вертикально.

Затем производится подсчет при увеличении 400-600 раз, передвигая мазок, нужно подсчитать в каждом поле зрения всех спермиев, учитывая отдельно нормальные и патологические формы спермиев: после чего вычисляют % патологических. Общее количество подсчитанных спермиев должно быть не менее 500.

Например: Сосчитано 500 спермиев и в их числе – 43 патологических. Составив пропорцию, вычисляют % патологических форм спермиев.

500 = 100%

43 = x

43х100

х =---------------= 8,6 %.

Задание: определить наличие патологических форм спермиев по следующей таблице:

Норма	Тератоспермия
Головка	Шейка	Тело	Жгутик

На основании полученных данных сделать выводы о качестве спермы.

ВЛИЯНИЕ НА СПЕРМИЕВ ФИЗИЧЕСКИХ

И ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

Влияние осмотического давления

Оценить спермин по подвижности. Затем к капле спермы добавить дистиллированной воды; 3%-ный р-р NaCl (каждого по капле). Наблюдать набухание спермиев под влиянием воды. Под влиянием 3%-ного NaCl наступает обезвоживание спермиев и через 1-2 минуты они погибают.

Влияние реакции среды

На предметное стекло наносят каплю спермы и действуют на нее 0,5%-ным р-ром уксусной кислоты. Капли перемешивают палочкой, покрывают покровным стеклом и замечают время, в течение которого спермин прекращают движение.

Влияние некоторых химических веществ

1. Смешать каплю спермы с мыльным раствором. Установить, когда прекратится движение. Вывод - остатки мыла губительно действуют на спермиев.

2. Воздействовать на сперму 2%-ным р-ром двууглекислой соды. Проследить, через сколько времени наступит гибель (как правило, через 2-4 мин.) Вывод - при мытье искусственных вагин тщательно ополаскивать камеру, чтобы не оставалось следов соды.

3. Воздействовать на сперму р-ром КМп0₄ 1: 1000. Сперма гибнет через 1-2 мин. Вывод - использовать как дезинфектор нельзя - медленно испаряется с поверхности.

4. Воздействовать 0,5%-ным р-ром спирта. Вывод - тщательное промывание шприца в трех флаконах (не менее 9 раз).

5. Воздействовать 0,02%-ным р-ром фурациллина - гибель через 2-3 мин. Вывод - при подготовке всех инструментов тщательно отмывать растворы физиологическим раствором.

 

ТЕМА: ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАЗБАВИТЕЛЕЙ

ДЛЯ РАЗБАВЛЕНИЯ СПЕРМЫ

В организме производителя - в придатке семенника спермии сохраняются до 60 дней. Этому способствует слабокислая среда и почти полное отсутствие солей.

Во время эякуляции к спермиям примешиваются секреты придаточных половых желез. В них растворено много солей, которые изменяют осмотическое давление и кислотность среды у быка и барана до нейтральной, у хряка и жеребца до слабощелочной. В результате спермии начинают активно двигаться.

При хранении спермы вне организма действие секретов придаточных половых желез становится вредным. Повышенная активность спермиев благодаря действию секретов, ведет к расходованию энергетических веществ (сахар) и накоплению молочной кислоты, что снижает переживаемость спермиев. Кроме того, калий и натрий, содержащиеся в секрете, нейтрализуют электрозаряд и приводят к спермоагглютинации.

Чем сильнее сперма разбавлена секретами, тем скорее она гибнет. Так свежая сперма хряка и жеребца гибнет при комнатной температуре через 1-2 часа с момента получения.

Таким образом, сперма гибнет вне организма от следующих факторов:

1. Вредное влияние секретов придаточных половых желез (особенно у жеребца и хряка).

2. Накапливание молочной кислоты и отравление спермиев продуктами обмена.

3. Израсходование питательных веществ (сахара).

4. Спермоагглютинация.

5. Температурный шок.

6. Действие попавших в сперму и размножившихся микроорганизмов.

Чтобы ослабить действие вредно действующих факторов сперму разбавляют. Разбавление должно не только предупредить потерю спермиями оплодотворяющей способности, а наоборот, способствовать повышению оплодотворяемости самок и предохранять от распространения инфекции.

Увеличение объема эякулята при разбавлении позволяет осеменить больше самок. К разбавителям спермы производителей должны предъявляться следующие требования:

1. Осмотическое давление в разбавителе должно равняться таковому спермы (8,3 атм. при температуре 38⁰С, при 0⁰С - 7,3 атмосфер).

2. Реакция разбавителя должна быть оптимальной РН - 7,2 - 7,6, т.е. слабощелочная.

3. Компоненты разбавителя должны обладать буферными свойствами.

4. В разбавителе должна быть соответствующая вязкость.

5. Компоненты разбавления не должны быть сами по себе вредными для спермиев.

6. В разбавителе должны быть компоненты, предохраняющие спермиев от температурного шока.

7. Компоненты разбавителя должны быть не электролитного характера (чтобы не снимать отрицательный заряд).

8. Иметь компоненты против развития или даже уничтожения микрофлоры.

9. Вещества разбавителя должны быть доступны и удобны при изготовлении и обращении с ними в работе.

Все компоненты разбавителя обеспечивают комплексное действие:

1. Питание спермиев.

2. Защита от температурного шока.

3. Буферность, т.е. сохранение в течение некоторого времени реакции спермы неизменной.

Чтобы разбавитель обеспечивал длительную переживаемость спермиев и высокую оплодотворяющую способность, он должен быть изотоничным, т.е. иметь осмотическое давление как в сперме животных того вида, для которого он предназначен.

Особо нужно обратить внимание на то, чтобы реактивы, употребляемые при приготовлении разбавителя, были высокого качества и хранились в сухом месте, в хорошо закрытых банках с этикетками. Отсыревшие реактивы употреблять нельзя, т.к. количество поглощенной ими воды невозможно учесть. Кроме того, в отсыревших сахарах быстро развивается микрофлора, разлагающая сахара, причем образуются вредные для спермиев продукты распада.

Особое внимание нужно обращать на состав лимонно-кислого натрия. Можно применять только трехзамещенный цитрат, имеющий солоновато- щелочной вкус. Двухзамещенный цитрат (с едким кислым вкусом) использовать нельзя.

Для разбавителя применять только дистиллированную воду.

Антибиотики, вводимые в сперму, как правило, оказывают положительное влияние на переживаемость спермиев. Однако некоторые соли пенициллина и стрептомицина снижают жизненность спермиев. Поэтому, каждую партию нужно проверять.

Состав разбавителя должен соответствовать характерным особенностям спермы данного вида животных. Так, для густой спермы барана и быка, в которой быстро накапливается молочная кислота, разбавитель должен содержать буферные соли (цитраты, фосфаты), нейтрализующие кислоту; для спермы жеребцов введение буферных соединений излишне.

Разбавители спермы жеребцов, не содержат солей, т.к. их и так много в плазме спермы, или содержат в небольших количеств. Наоборот, добавление в разбавители сахаров значительно улучшает переживаемость спермиев. Сахара - глюкоза, сахароза и в особенности фруктоза, а так же лецитин, вводимый с желтком, является для спермиев энергетическим материалом, и поэтому они входят в состав большинства разбавителей. Сахара предохраняют спермиев от электроразряда.

Разбавители приготовляют непосредственно перед употреблением:

	Бык	Баран
Вода дистиллированная	100 мл
Глюкоза	3,0	0,8
Натрий лимоннокислый	1,4	2,8
Желток свежего куриного яйца	20 мл
Спермосан-3	50-75 тыс. ед.

В этом рецепте глюкоза и натрий лимонно-кислый выполняют роль буфера редуцирующих веществ, питательных свойств и др., поддерживающих постоянную реакцию, а вещество желтка - лецитин сохраняет спермии от температурного шока, выполняя, однако и роль буфера (отчасти).

Для получения желтка свежее куриное яйцо обмывают, обтирают спиртовым тампоном, разбивают и отделяют белок от желтка. Набирают и отмеривают желток с помощью пипетки или шприца (по инструкции). Практически на 100 мл разбавителя берется два желтка без всяких «отмериваний».

Приготовление разбавителя.

Взять навеску глюкозы и навеску лимонно-кислого натрия. Перенести в чистую банку, отмерить нужное количество дистиллированной воды и смешать.

После приготовления «буфера» отмеряем и вносим в него в нужном количестве желток. Разбавитель перед разбавлением спермы надо подогреть до 25-30⁰С, чтобы не наступил температурный шок. Пипетку, которой будем брать свежеполученную сперму, тоже надо подогреть трением о руку или салфетку. Также подогревается и предметное стекло. Не одно и то же добавлять разбавитель в сперму или сперму в разбавитель. Если мы добавляем сперму в разбавитель, то понижается резистентность и оплодотворяющая способность спермы. Поэтому нужно обязательно добавлять разбавитель в сперму, а не наоборот.

Причины понижения жизнеспособности при добавлении спермы к разбавителю пока еще не известны. Приготовленный разбавитель годен только 3-4 часа. Во время разбавления спермы разбавитель держат в водяной бане при температуре - 30- 35⁰С. Сперма быка разбавляется 1:19, или 1:49, т.е. к одному объему спермы приливают от 19 до 49 объемов синтетической среды. Разбавление получается, таким образом, от 20 до 50 раз. После разбавления проверяют активность спермы под микроскопом. Если активность снижается, то разбавитель бракуют и заменяют свежим, вновь приготовленным. Сперму, если она после оценки на активность и густоту признана годной, непосредственно в спермоприемнике разбавляют 1:1 или 1:2, выдерживают 5-10 мин., переливают в градуированный смеситель или мензурку и измеряют объем. Затем разбавляют до необходимого объема и концентрации.

Сперму быка разбавляют в 20-50 и более раз, чтобы в одной дозе при всех способах хранения перед осеменением было не менее 15 млн. спермиев с ППД 4 балла (40%).

Сперму барана разбавляют в 2 (1:1) - 4 (1:3) с концентрацией в дозе не менее 80 млн. спермиев.

Сперму хряка разбавляют в 2 (1: 1) - 10 (1:9) раз с концентрацией в дозе не менее 3 млрд. спермиев через 30-60 мин после взятия и определения качества.

Сперму жеребца разбавляют в 4 (1:3) раза с концентрацией в дозе не менее 3 млрд. спермиев.

Разбавленная сперма охлаждается в специальных термосах, до 0⁰С. В этих же термосах она и транспортируется.

На пенициллиновых флаконах с разбавленной спермой укрепляется этикетка, на которой обозначаются дата, время, кличка быка, объем разбавленной спермы, степень разбавления, активность разбавленной спермы.

На флакон надевается резиновая муфта, и он помещается на хранение в термос.

Оценка сохранения спермы

Для проверки активности сохраненной спермы из термоса берется флакон, сперма во флаконе осторожно перемешивается, капля с помощью палочки наносится на предметное стекло, предварительно подогретое, накрывается покровным стеклом и помещается на обогревательный столик. С боку покровного стекла (под него) вводится капля 3% р-ра цитрата натрия для подщелачивания и нейтрализации молочной кислоты, образовавшейся за период хранения. Итак: 1. Перемешать сперму во флаконе; 2. Температура 40-45⁰С; 3. Цитрат натрия 3%.

Техника приготовления

1. Как готовить весы

2. Как брать капсуляторку

3. Как готовить навеску

4. Как добавлять антибиотик

5. Как добавлять стрептоцид

6. Как добавлять желток

7. Биоконтроль разбавителей

8. Синтетические разбавители

9. Маркировка: Стрелков и Родин рекомендуют: индиго (синяя), амарант (красная), тетразин и нафтол-гельб (желтые). Растворить 0,12 г краски в 3% -ном р-ре цитрата и добавить 0,1-0,3 р-ра на 100 мл разбавителя.

Сперма жеребца разбавляется 1:2-5. Сперма хряка - 1:3-5.

Разбавители заполнители:

Глюкозо-солевой - 1000 мл дистиллированной воды - 30 г глюкозы, 4,5 г хлористого натрия.

Солевой - 100 мл Н₂О+ 9 г хлорида натрия.

Нейтрализованный цитрат: к 100 г обычного цитрата добавляют 3,5 г лимонной кислоты.

ПЕРЕВОЗКА СПЕРМЫ

Транспортировать на дальние расстояния можно только разбавленную сперму.

Сперма, разбавленная желточной средой, может сохраняться и перевозиться в широкогорлых пищевых термосах, заполненных льдом. Сперма при этом разливается во флаконы или пробирки с плотными пробками, которые помещаются в резиновые мешочки, их кладут на дно термоса и закладывают сверху льдом. Предварительного постепенного охлаждения сперма с желточной средой не требует.

Термос емкостью 1 л поддерживает температуру в пределах от 0⁰С до 1, при наличии не менее 200 г льда. При морозе от 0 до 5⁰С не требуется никаких предосторожностей против замораживания спермы. При температуре ниже 5⁰С необходимо защитить термос, войлочным или ватным чехлом. При морозах ниже 20⁰С в термос вместо льда наливают холодную воду (5-8⁰) и сразу после зарядки выносят на мороз. Заряженный термос можно держать на морозе до 2-3-х суток (пока не замерзнет 2/3 объема налитой воды), без опасения заморозить сперму. Горловину и крышку термоса в морозную погоду нужно смазать вазелином или маслом во избежание примерзания и заедания пробки и крышки. Термос упаковывается в специальный футляр, фанерный или металлический.

Для преподавателя. Рассказать о «взрывах» термосов, рекомендовать класть на дно вату, а ампулы опускать пинцетом. Об этикетках на термосах и прочей документации. Транспорт по ж.д., прием на пунктах. Проверка качества спермы на передаточных пунктах (вет. лечебница, Госплем. рассадник)

ТЕМА: ЗАМОРАЖИВАНИЕ СПЕРМЫ

МЕТОД ОДНОМОМЕНТНОГО РАЗБАВЛЕНИЯ И БЫСТРОГО ЗАМОРАЖИВАНИЯ СПЕРМЫ В ФОРМЕ ГРАНУЛ В ЖИДКОМ АЗОТЕ

Материалы:

1. Фторопластовая пластинка с лунками или двуокись углерода (сухой лед).

2. Кювета для жидкого азота.

3. Шприц на 2 мл.

4. Иглы для взятия крови.

5. Спиртовые тампоны.

6. Корнцанг.

Способ медленного двухмоментного замораживания спермы быков все больше уступает место более производительному и быстрому замораживанию, при котором глубокое охлаждение спермы в форме гранул до температуры жидкого азота (-196⁰С) достигается в течение нескольких минут. В результате удается лучше сохранить структуру спермиев, получать относительно более высокую активность спермы после оттаивания.

Технология:

1. Свежеполученная сперма быка оценивается на густоту, активность, определяется концентрация.

2. Сперма быков разбавляется одномоментно от 1:1 до 1:10. Степень разбавления зависит от того, какие гранулы или пайеты применяют на пунктах искусственного осеменения, а так же от количества содержания спермиев.

3. При разбавлении спермы необходимо, чтобы разбавитель и все предметы, с ней соприкасающиеся, имели температуру +30-35⁰С.

4. После разбавления сперма помещается в холодильник при температуре +2+4⁰С на 4 ч (эквилибрация). После чего необходимо проверить активность, которая должна быть не менее 8 баллов.

5. Сперма после эквилибрации подвергается замораживанию (витрификации) в жидком азоте. Для этого выполняются следующие действия:

а) фторопластовая пластина с лунками погружается в жидкий азот на 1 мин, затем поднимается над поверхностью жидкого азота на расстоянии 7-10 см и закрепляется на штативе и выдерживается в течение 5 минут;

б) пластина со спермой погружается в жидкий азот на 2 мин;

в) пластина вынимается из жидкого азота, гранулы пересыпаются на шумовку и затем в марлевый мешочек или специальную тубу. Мешочек опускается в канистру, помещенную в сосуд Дьюара.

Затем одна гранула оттаивается для оценки активности и смотрится под микроскопом. Активность должна быть не менее 4 балла, живых спермиев – не менее 15 млн.