Методи кількісного обліку мікроорганізмів

Прямий підрахунок клітин мікроорганізмів проводять в камерах Горяєва, Тома-Цейса, Бюркера та ін. В них проводять підрахунок клітин дріжджів, спор, клітин деяких бактерій. Камера Горяєва представляє собою товсте предметне скло, розділене чотирма прорізами на три поперечно розташовані площадки. Центральна площадка поздовжнім прорізом ділиться на дві рівні частини. На кожній половині вигравірувана сітка. Бокові площадки розташовані на 0,1 мм вище центральної та використовуються для притирання покривного скла.

Сітка камери Горяєва розділена на 225 великих квадратів (15 рядів по 15 квадратів в кожному). Площа великого квадрата розділена на 16 малих квадратів.

В процесі підрахунку на поверхню сіток наносять невеликі крапельки проби (чи її розведення). Для того щоб об’єм проби точно відповідав розрахунковому об’єму камери, покривне скло притирають до її бокових площадок до появи так званих Ньютонових кілець. Рідина під покривним склом повинна розподілитися по всій сітці рівномірно, без пухирців повітря. Підрахунок клітин проводять через 3-5 хв. після заповнення камери, щоб клітини осіли та знаходилися в одній площині. Рухомі форми мікроорганізмів перед нанесенням на сітку необхідно вбити нагріванням або внесенням 0,5% формаліну.

Камеру розміщають на предметному столику мікроскопа та роздивляються спочатку з об’єктивом 8´, потім 40´. Клітини підраховують в 5 (10) великих квадратах по діагоналі або по кутах сітки і в центрі. Враховують всі клітини, що знаходяться всередині квадрату або на межі обмежувальних ліній квадрата (якщо клітини більш ніж наполовину знаходяться всередині квадрата). Клітини, що пересікаються обмежувальними лініями квадрата навпіл, рахують тільки на двох з чотирьох сторін квадрата, а клітини, що розташовуються за межами квадрата не враховують.

Кількість клітин в 1 мл:

,

де a – сума клітин, підрахована в 5 (чи 10) великих квадратах сітки; b – розведення вихідного субстрату; c – кількість малих квадратів, в яких проводили підрахунок.

Визначення кількості клітин методом посіву на щільні середовища. Метод знайшов широке застосування для встановлення кількості мікроорганізмів в природних та промислових субстратах. Метод ґрунтується на тому, що кожна жива клітина при висіві на щільне середовище утворює колонію. Виконання аналізу складається з 3 етапів.

Приготування десятикратних розведень в стерильній водопровідній воді чи фізіологічному розчині (0,5% розчин NaCl).

Посів на щільні середовища. Кожне розведення висівають на 2-4 паралельні чашки Петрі поверхневим чи глибинним способом. При поверхневому посіві в стерильні чашки спочатку вносять по 15-20 мл розплавленого агаризованого середовища. Залиті чашки рекомендується витримати 1-2 доби в термостаті при 30 °С для підсихання середовища та перевірки на стерильність. Для посіву використовують стерильні мірні піпетки, якими переносять в чашки визначений об’єм суспензії (0,05; 0,1; 0,2 мл але не більше 0,5 мл) відповідного розведення. Внесений об’єм стерильним шпателем рівномірно розподіляють по всій поверхні щільного середовища. Висів проводять не менш ніж з трьох послідовних розведень.

При глибинному посіві, по 1 мл відповідного розведення стерильною піпеткою вносять в 2-4 паралельні стерильні чашки Петрі, заливають їх розплавленим (попередньо охолодженим до 40-45 °С) агаризованим середовищем. Кришку чашки закривають і легкими обертальними рухами ретельно перемішують середовище з суспензією мікроорганізмів. Засіяні чашки залишають в горизонтальному положенні для застигання середовища. Чашки перевертають та переносять в термостат де підтримується температура сприятлива для вирощування даного виду мікроорганізмів.

Підрахунок колоній. Різні групи мікроорганізмів володіють різною швидкістю росту. Тому колонії бактерій підраховують через 2-3 доби, грибів та дріжджів – через 5-7 діб, актиноміцетів – через 7-15 діб. Для підрахунку вибирають чашки, в яких колоні є ізольованими, а їх кількість знаходиться в межах 50-300. При великій кількості колоній дно чашки ділять на 4, 8 або 16 однакових за площею секторів, підраховують кількість колоній в кожному секторі, після чого результати підсумовують. Можна підраховувати число колоній в декількох секторах, але не менш ніж на ⅓ площі середовища, визначити середнє арифметичне число колоніѹ на них та помножити на загальну кількість секторів чашки. Підрахунок колоній також проводять на спеціальних напівавтоматичних лічильниках.

Результати паралельних висівів підсумовують та визначають середнє число колоній, які виросли при висіві розведення. Якщо середнє число колоній є меншим за 10, ці результати для визначення кількості клітин в вихідному матеріалі не враховують. Кількість клітин мікроорганізмів в 1 г (мл) досліджуваної проби розраховують за формулою:

,

де a – середнє число колоній при висіві розведення; n – розведення вихідного матеріалу; c – наважка препарату, г (мл); v – об’єм суспензії, взятої для посіву, мл.