С основами общей и частной вирусологии

↑

▷ Содержание

Стр 1 из 21Следующая ⇒

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ

ПО ОБЩЕЙ МИРОБИОЛОГИИ

С ОСНОВАМИ ОБЩЕЙ И ЧАСТНОЙ ВИРУСОЛОГИИ

САРАНСК

2003

УДК

Составители: Л.В. Новикова, И.П. Куторкина, И.С. Романова.

Методические указания к лабораторным занятиям по общей микробиологии с основами общей и частной вирусологии. // Сост.: Л.В.Новикова, И.П.Куторкина, И.С.Романова. – Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2003. –  64 с.

       Методические указания написаны в соответствии с программой по микробиологии с вирусологией. Содержат планы занятий, задания для выполнения лабораторной работы, вопросы для самостоятельной подготовки к занятиям, основные методы изучения микроорганизмов и вирусов, дополнительный материал.

       Предназначены для студентов III курса дневного отделения биологического факультета специальности «Биоэкология».

Печатается по решению научно-методического совета Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева. 

ЗАНЯТИЕ 1

Тема: МИКРОБИОЛОГИЯ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ БИОЭКОЛОГИИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. МОРФОЛОГИЯ МИКРОБОВ.

Цель занятия: ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории, с методами изучения микроорганизмов, освоить технику иммерсионной микроскопии; освоить технику приготовления и простых методов окраски мазков-препаратов.

План занятия.

1. Распространение микробов в окружающей среде. Роль микробов в живой и неживой природе.

2. Микробиологическая лаборатория. Оборудование, правила работы, организация рабочего места.

3. Методы изучения микроорганизмов (микроскопический, бактериологический, экспериментальный, серологический, кожно-аллергический).

4. Микроскопический метод исследования. Виды современных микроскопов. Иммерсионная микроскопия.

5. Тинкториальные свойства бактерий. Этапы приготовления мазков-препаратов. Простые методы окраски.

6. Морфология бактерий. Измерение размеров микробных клеток.

Задания для выполнения лабораторной работы.

1. Ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории.

Выполняя микробиологические исследования, необходимо соблюдать следующие правила:

- в лаборатории должны работать в медицинских халатах, шапочках и сменной обуви. Вход в лабораторию без халата категорически воспрещен. В необходимых случаях работающие надевают на лицо маску из марли. Работа с особо опасными микробами регламентируется специальной инструкцией и проводится в режимных лабораториях;

- с инфицированным материалом работают только с помощью инструментов (бактериологические петли, пинцеты, корцанги и др.);

- прикасаться руками к исследуемому материалу запрещается;

- при посеве материала делают надпись на пробирках и чашках Петри и пр.;

- материал высевают в пробирки и чашки Петри вблизи от пламени горелки с обжиганием бактериологической петли и краев пробирки;

- растворы, содержащие патогенные микроорганизмы, забирают пипеткой с помощью резинового баллона;

- в лаборатории запрещается курить и принимать пищу;

- рабочее место должно содержаться в образцовом порядке. Личные вещи следует хранить в специально отведенном месте;

В ходе работы и по ее окончании применяются следующие способы дезинфекции:

- при случайном попадании инфицированного материала на стол, пол и другие поверхности это место необходимо тщательно обработать дезинфицирующим раствором;

- руки обрабатывают дезинфицирующим раствором, а затем моют с мылом;

- помещение дезинфицируют с помощью бактерицидных ламп и путем обработки поверхности лабораторной мебели дезинфицирующим раствором.

2. Ознакомиться с оборудованием микробиологической лаборатории.

Лаборатории снабжены рядом обязательных приборов и аппаратов:

1. Приборы для микроскопии: биологический иммерсионный микроскоп с дополнительными приспособлениями (осветитель, фазово-контрастное устройство, темнопольный конденсор и др.), люминесцентный микроскоп.
2. Термостаты и холодильники.
3. Приборы для приготовления питательных сред, растворов и т.д.: аппарат для получения дистиллированной воды (дистиллятор), технические и аналитические весы, рН-метры, аппаратура для фильтрования, водяные бани, центрифуги.
4. Набор инструментов для манипуляций с микробами: бактериологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.
5. Лабораторная посуда: пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флаконы, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки и др., аппарат для изготовления ватно-марлевых пробок.
6. Аппаратура для стерилизации: автоклавы, сухожаровые шкафы, бактерицидные лампы.

Каждое рабочее место снабжается спиртовкой и сосудом с дезинфицирующим раствором. 

3. Приготовить мазок с агаровой культуры стафилококка, окрасить метиленовой синей, изучить под микроскопом.

Методы окраски препаратов.

    Существуют простые и сложные методы окраски. При окраске простым методом используется только один краситель – водный фуксин (окрашивание производят 1-2 мин)

и метиленовый синий (окрашивание производят 3-5 мин). После истечения времени окрашивания препарат промывают дистиллированной водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем мазки высушивают на воздухе, при комнатной температуре, или осторожно промокая фильтровальной бумагой. 

4. Приготовить мазок бульонной культуры кишечной палочки, окрасить водным раствором фуксина, изучить под микроскопом.

       Ведущим методом исследования в микробиологической лаборатории является микроскопический метод. Для микроскопического исследования применяют биологические микроскопы отечественных моделей: «Биолам – р 11», «Биолам – р 15», «Биолам – 17» и др. Также используют еще несколько типов микроскопов: люминесцентный, электронный (просвечивающий электронный микроскоп, сканирующий электронный микроскоп) и специальные методы микроскопии: иммерсионная световая, фазово-контрастная, аноптральная (амплитудноконтрастная, фазовотемнопольная), интерференционная, поляризационная, темнопольная люминисцентная, метод сколов (замораживание – скалывание), иммунофлуоресцентные методы.

5. Освоить технику иммерсионной микроскопии.

- на приготовленный и окрашенный мазок нанести каплю иммерсионного масла и поместить препарат на предметный столик;

- установить иммерсионный объектив х 90 в рабочее положение, осторожно опустить тубус микроскопа вниз до погружения фронтальной линзы иммерсионного объектива в каплю масла.

- установить ориентировочный фокус при помощи макровинта. Окончательную фокусировку произвести микровинтом.

6. Изучить под микроскопом демонстрационные препараты.

Вопросы для обсуждения.

1. Предмет микробиология, основные понятия. 2. Роль микробов в живой и неживой природе. 3. Правила работы в микробиологической лаборатории. 4. Оборудование и организация работы микробиологической лаборатории. 5. Методы изучения микроорганизмов: микроскопический, бактериологический, экспериментальный, серологический, кожно-аллергический. 6. Виды современных микроскопов. 7. Правила работы с микроскопом. 8. Изучение микроорганизмов микроскопическим методом. 9. Изучение микробов методом иммерсионной микроскопии. 10. Тинкториальные свойства микроорганизмов. 11. Техника приготовления мазков-препаратов. 12. Простые методы окраски микроорганизмов. 13. Морфология бактерий. 14. Измерение размеров микробной клетки с помощью окуляр-микрометра и объект-микрометра.

Оформление лабораторной тетради.

    Записать правила работы в микробиологической лаборатории; зарисовать самостоятельно приготовленные и демонстрационные микропрепараты с различной морфологией микробов.

Дополнительный материал.

Рис. 1. Принципиальная схема светового микроскопа

ЗАНЯТИЕ 2

План занятий.

1. Ультраструктура бактериальной клетки. Постоянные структурные элементы (нуклеоид, цитоплазма, цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка, мезосомы, рибосомы), их строение и функции.

2. Особенности строения клеточной стенки микробов. Грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы. Окраска по Граму, механизм, значение для классификации бактерий.

3. Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Протопласты и сферопласты.

4. Непостоянные структурные элементы бактериальной клетки (капсула, споры, жгутики, включения, ворсинки). Методы их выявления.

5. Исследование микробов в живом состоянии. Характеристика методов «висячей» и «раздавленной» капли.

Задания для выполнения лабораторной работы.

1. Приготовить мазки из смеси культур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, окрасить по Граму, изучить под микроскопом.

       Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выяснить определенные структуры бактериальной клетки.

Окраска по Граму. Все бактерии по отношению к окраске по Грамму делятся на грамположительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного. Способность микроорганизмов окрашиваться в тот или иной цвет зависит от их химического состава. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют ароматические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. Кроме того, у грамположительных бактерий имеется магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которой нет у грамотрицательных. Она и образует прочный химический комплекс с белком, генциан-виолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется.

Техника окраски по Граму.

- окрасить мазок генциан-виолетом (2 мин, через фильтровальную бумагу);

- бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

- окрасить мазок раствором Люголя (1 мин);

- раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (на 30-40 с осторожно покачивая стеклом);

- тщательно смыть спирт водой;

- окрасить водным фуксином 2 мин);

- промыть водой и высушить при помощи фильтровальной бумаги.

Мазок поместить на предметный столик микроскопа, нанести в центр каплю иммерсионного масла, промикроскопировать. Зарисовать грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

       Некоторые виды бактерий образуют внутриклеточные (эндогенные) споры. В отличие от вегетативной клетки они обладают меньшим количеством свободной воды, а так же высоким содержанием липидов и кальция.

       Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из за малой проницаемости оболочки. Проницаемость оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раствора краски с подогревом.

Вопросы для обсуждения.

1. Постоянные и непостоянные структурные элементы микробной клетки. 2. Внутренние и поверхностные структурные элементы микробной клетки. 3. Строение и функции постоянных структурных элементов (нуклеоид, цитоплазма, цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка, мезосомы, рибосомы). 4.  Дифференциация бактерий с помощью окраски по Граму. 5. Особенности строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 6. Техника окраски микробов по Граму. 7. Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 8. Строение и функции непостоянных структурных элементов бактериальной клетки (капсула, споры, жгутики, включения, ворсинки). 9. Методы выявления непостоянных структурных элементов микробов: Шеффера-Фултона, Ожешко, Циля-Нильсена, Бури-Гинса, Нейссера. 10. Характеристика методов исследования микроорганизмов в живом состоянии. 11. Этапы методов «висячей» и «раздавленной» капли.     

Оформление лабораторной тетради.

    Переписать в тетрадь таб. 1; зарисовать микропрепараты из исследуемого материала с окраской по Грамму и Бури-Гинсу; зарисовать демонстрационные препараты.

Дополнительный материал.

Таблица 1

Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов

ЗАНЯТИЕ № 3

План занятий.

1. Понятие об эукариотах и прокариотах, их отличительные признаки, представители.

2. Характеристика актиномицетов как переходной группы микроорганизмов от истинных бактерий к грибам.

3. Морфология и ультраструктура спирохет. Классификация спирохет.

4. Особенности морфологии и структуры микоплазм. Полиморфизм микоплазм. Патогенные виды. Стабильные и нестабильные L-формы бактерий.

5. Положение в систематике микроорганизмов риккетсий и хламидий. Их морфология, строение и химический состав.

6. Основные методы окраски прокариотических микроорганизмов.

Задания для выполнения лабораторной работы.

1. Изучить под микроскопом и зарисовать демонстрационные препараты прокариотических микроорганизмов: актиномицетов, спирохет, риккетсий.

2. Приготовить мазок из зубного налета, окрасить по методу Романовского-Гимзе, изучить под микроскопом и зарисовать обнаруженные формы микроорганизмов.

    Окраска по Романовкому-Гимзе относится к сложным методам и применяется для изучения морфологии простейших. Этот метод окраски позволяет выявить ядерные элементы клеток простейших и включения.

Вопросы для обсуждения.

1. Понятие об эукариотах и прокариотах, представители. 2. Отличительные признаки эукариотических и прокариотических клеток. 3. Структурно-морфологические особенности актиномицетов. 4. Актиномицеты как переходная группа от истинных бактерий к грибам. 5. Морфология и структура спирохет. 6. Классификация спирохет. 7. Спирохеты как переходная группа от прокариот к простейшим. 8. Особенности морфологии и структуры микоплазм. 9. Полиморфизм микоплазм. 10. Стабильные и нестабильные L-формы бактерий. 11. Морфология и структура риккетсий и хламидий. 12. Отличительные признаки риккетсий и хламидий от вирусов и истинных бактерий. 13. Основные методы окраски актиномицетов, спирохет, риккетсий, хламидий и микоплазм. 14. Техника окраски микроорганизмов по методам Романовкого-Гимзе и Здродовского.

Оформление лабораторной тетради.

Записать таб. 2,3; зарисовать микропрепараты из исследуемого материала с окраской по Романовскому-Гимзе; зарисовать демонстрационные препараты.

Дополнительный материал.

Таблица 2 

Основные различия клеток прокариотов (эубактерий) и эукариотов  

Генетический материал

Синтез белка

Клеточная стенка*

Род

Мицелий

Вегетативные споры

Бензойная кислота

121

Морфология

Окраска по методу Грама

Характер роста

Биохимические свойства

Наименование

рода и вида

к

о

л

о

н

и

й

н

а

б

у

л

ь

о

н

е

н

а

а

г

а

р

е

ферментация

Обра-зова-ние