Тема: Дыхание микроорганизмов. Выделение чистой культуры анаэробов. Рост и размножение микробов. Дезинфекция.

Цель занятия: изучить морфологию анаэробов, освоить методы культивирования анаэробов и методы выделения чистой культуры анаэробов, продолжить выделение чистой культуры аэробов (3-й день).

План занятия.

1. Дыхание микроорганизмов. Типы дыхания. Процесс брожения.

2. Методы культивирования анаэробов.

3. Методы выделения чистой культуры анаэробов.

4. Рост и размножение микробов.

5. Понятие о дезинфекции.

 

Задания для выполнения лабораторной работы.

 

1. Продолжить выделение чистой культуры аэробов (третий день): а) сделать мазок посева на скошенном агаре, окрасить по Граму, изучить под микроскопом для проверки чистой культуры; б) для изучения биохимических свойств выделенной культуры сделать посев на ряд Гиса и МПБ.

2. По демонстрационному материалу познакомиться с морфологией анаэробов – возбудителей столбняка, ботулизма и газовой гангрены. Зарисовать микропрепараты.

3. Познакомиться с методами культивирования анаэробов. Записать их.

       Необходимым условием культивирования анаэробных бактерий является создание анаэробных условий, что достигается с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов.

Физические методы

1. Кипячение питательной среды на водяной бане в течение 15-20 мин, с последующим охлаждением до 45-50°С.

После посева питательную среду заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.

2. Посев в высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды.

3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из (анаэростатов, анаэробных боксов) с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азот, аргон, гелий). Для поглощения водных паров на дно анаэростата помещают 5-6 г хлористого кальция, 10-12 г силикогеля или 20-30 г хлористого натрия.

Химические методы

1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде. Для поглощения кислорода из 220 мл воздуха применяют смесь, состоящую из 1 мл 20% раствора пирогаллола и 1 мл насыщенного раствора карбоната натрия (Na₂CO₃).

2. Для связывания остатков кислорода в предназначенных для роста анаэробов питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота, тиогликолят натрия (0,01 – 0,02%), аскорбиновая кислота (0,1%), различные сахара (0,1 – 3%), цистин и цистеин (0,03 – 0,05%), муравьинокислый натрий (0,25 – 0,75%) и др.

Биологические методы

1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри засевают исследуемый материал, а на другую – культуру аэробного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрыть крышкой, края которой заливают парафином.

2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают кислород, в результате в среде создаются анаэробные условия.

Для предотвращения попадания кислорода сосуды с питательными средами закрывают резиновыми пробками.

Методы выделения чистой культуры

1. Метод Цейсселера. Исследуемый материал засевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэробные условия и культивируют в термостате при 37°С в течение 24-72 ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают в среду для контроля стерильности (СКС) или среду Китта-Тароцци.

2. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл раствора хлористого натрия, перемешивают и переносят в пробирку с охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания последовательно засевают еще в две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей холодной воды. Выросшие через 24-72 ч в глубине агара изолированные колонии анаэробов засевают в среду Китта-Тароцци.

3. Метод Перетуа. Готовят разведения исследуемого материала как указано выше. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках лежит стеклянная пластинка размером 6х6 см. Среду заливают таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри. При появлении микробного роста стеклянную пластинку удаляют, а изолированные колонии засевают в пробирку со средой Китта-Тароцци для получения чистой культуры.

 

Вопросы для обсуждения.

1. Дыхание микроорганизмов. 2. Типы дыхания микробов. 3. Пути получения энергии микроорганизмами. 4. Процесс окислительного фосфорилирования у микроорганизмов с аэробным типом дыхания. 5. Процесс субстратного фосфорилирования у микробов с анаэробным типом дыхания. 6. Процесс брожения, типы. 7. Физические методы создания условия для культивирования анаэробов. 8. Химические методы создания анаэробных условий. 9. Биологические методы создания анаэробных условий.              10. Методы выделения чистой культуры анаэробов: Цейселера, Вейнберга, Перетуа. 11. Рост и размножение микроорганизмов. 12. Понятие о дезинфекции. 13. Основные классы дезинфицирующих средств.  

 

Дополнительный материал.

  

 I – исходная фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза логарифмического роста; IV – фаза замедления роста; V – стационарная фаза; VI – фаза ускорения гибели; VII – фаза логарифмической гибели; VIII – фаза замедления гибели; IX – фаза гибели или спорообразования.

Рис. 6.Фазы роста микробной популяции.

Оформление лабораторной тетради.

 

Описать ход исследования при выделение чистой культуры аэробов (3-й день); зарисовать микропрепараты возбудителей столбняка, ботулизма, газовой гангрены; записать методы культивирования анаэробов; зарисовать с таблицы схему выделения чистой культуры анаэробов; зарисовать фазы роста микробной популяции.

 

ЗАНЯТИЕ № 8