Практический навык по микробиологии

ПРАКТИЧЕСКИЙ НАВЫК ПО МИКРОБИОЛОГИИ

 

для студентов лечебного, педиатрического факультетов

и факультета иностранных учащихся

 

Общая МИКРОБИОЛОГИЯ

Правила работы на кафедре микробиологии

Работа на кафедре микробиологии и в бактериологической лаборатории требует строгого соблюдения специальных правил, так как исследования проводятся с использованием культур условно-патогенных микроорганизмов и материала от больных иэкспериментальных животных.

Соблюдение этих правил необходимо для обеспечения не только личной безопасности, но и безопасности окружающих.

Запрещается

1. Работать в учебных лабораториях без халатов.

2. Входить в учебные лаборатории в головных уборах и верхней одежде.

3. Курить и принимать пищу в учебных лабораториях кафедры.

4. Класть на столы или пол в учебных лабораториях портфели, рюкзаки, сумки и пакеты.

 

Перед началом работы студент обязан:

1. Надеть медицинский халат, аккуратно застегнув его на все пуговицы.

2. Портфели, сумки, пакеты, книги и другие личные вещи положить в предназначенный для личных вещей студентов шкаф.

3. Проверить состояние рабочего стола и микроскопа. О всех обнаруженных недочетах немедленно сообщить своему преподавателю (Рабочий стол и микроскоп закрепляют за студентом на все время его работы на кафедре).

 

Обязанности студентов и дежурных во время лабораторной работы:

(На каждое занятие назначают 1-2 дежурных из состава группы)

Дежурные принимают учебный материал от преподавателя и раздают его студентам.

Во время лабораторной работы необходимо:

– содержать рабочее место в образцовом порядке и чистоте;

– бережно обращаться с микроскопом, посудой, инструментами и другими предметами лабораторного оборудования;

– проявлять максимальное внимание ко всем этапам работы с культурами микроорганизмов;

– в случае загрязнения заразным материалом поверхности стола и других предметов, кожи рук и лица также немедленно сообщить о случившемся преподавателю.

Обязанности студентов и дежурных по окончании работы:

1. Привести в порядок рабочее место.

2. Все использованные предметные стекла положить в указанное преподавателем место.

3. Все засеянные пробирки и чашки сдать дежурному для помещения в термостат.

4. Отработанный материал также сдать дежурному для стерилизации.

5. Привести в порядок микроскоп. После проверки преподавателем состояния микроскопа поставить его в шкаф.

6. Обработать руки дезинфицирующим раствором и тщательно вымыть их с мылом.

7. Дежурному вменяется в обязанность проверить состояние рабочих столов и устранить дефекты уборки; выключить свет.

Самостоятельная работа студентов на лабораторных занятиях:

1. Засев патологического материала на питательные среды.

2. Изучение выросших колоний.

3. Приготовление мазков.

4. Фиксация препаратов.

5. Окрашивание препаратов.

6. Микроскопическое исследование препаратов.

7. Зарисовка просмотренных препаратов.

8. Просмотр демонстрационных материалов, оформление и подпись протокола занятия.

9. Уборка рабочего места.

10. По окончании лабораторной работы вымойте руки с мылом и при необходимости обработайте дезинфицирующим раствором.

Методические указания:

Микроскопирование

Перед началом работы проверьте исправность микроскопа и чистоту оптики.

1. Тубус 2. Конденсор 3. Объективы 4. Макровинт 5. Предметный столик микроскопа 6. Окуляр

 

1. Поднимите до упора конденсор, поднимите тубус.

2. Установите объектив малого увеличения (8х).

3. Вращая зеркало, отрегулируйте освещение так, чтобы все поле зрения было освещено равномерно и ярко.

4. На приготовленный и окрашенный мазок нанесите небольшую каплю иммерсионного масла.

5. Поместите препарат на предметный столик микроскопа.

6. Окрашенные препараты рассматривают только с иммерсионным объективом (ОИ 100х). Поворачивая револьвер, установите объектив ОИ 100х (объектив с большим увеличением).

7. Осторожно опустите объектив с помощью макровинта до соприкосновения с маслом.

8. Наблюдая в окуляр, проведите грубую фокусировку макровинтом.

9. Окончательную фокусировку произведите с помощью микровинта (вращение микровинта допускается в пределах одного оборота).

10. Во время микроскопирования правой рукой производите вращение микровинта, левой – передвижение препарата.

Примечание:

В тубус микроскопа сверху вставлен окуляр, а в нижней части он снабжен вращающимся по кругу револьвером, в отверстия которого ввинчиваются объективы. Вращая револьвер, можно подвести любой объектив, который после легкого щелчка закрепится на месте.

Окуляры имеют две линзы (верхнюю и нижнюю). Расстояние между линзами равно полусумме их фокусных расстояний. С уменьшением фокусного расстояния повышается увеличение окуляра. Короткие окуляры будут более сильными, а более слабыми – длинные. Окуляры обозначают по тому увеличению, которые они дают (5х, 7х, 10х, 12х, 15х).

Объективы подразделяются на сухие и иммерсионные. Сухим называют такой объектив, между линзой которого и рассматриваемым препаратом находится воздух. В микробиологии используется иммерсионный объектив (погруженный в масло - кедровое или касторовое, укропное, вазелиновое или др.). Между линзой и рассматриваемым препаратом находится масло (однородная среда). Получается система: стекло препарата – иммерсионное масло – стекло объектива (с одинаковым показателем преломления). Благодаря маслу все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, чем улучшают изображение микробов, делают его более четким. На оправе объектива обозначается даваемое им увеличение (8х, 10х, 20х, 40х, 100х).

Общее увеличение микроскопа равняется произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, иммерсионный объектив с увеличением х100 и окуляром 10х дает увеличение объекта в 1000 раз.

Конденсор состоит из системы линз, предназначенных для собирания лучей, идущих от зеркала, в одной точке – фокусе, который должен находиться в плоскости рассматриваемого препарата. При микроскопировании с дневным светом конденсор должен быть поднят до уровня предметного столика. При изучении неокрашенных объектов следует опускать конденсор.

Бинокулярный микроскоп имеет два тубуса с окулярами. При наблюдении объекта обоими глазами одновременно достигается большая резкость глубины, меньше утомляется зрение.

Приготовление мазка

1. На обезжиренное предметное стекло нанесите петлей каплю физиологического раствора.

2. В правую руку возьмите бактериологическую петлю.

3. Простерилизуйте петлю:

вносим в пламя горелки – строго вертикально (прокаливам до раскаливания);

затем переводим в горизонтальное положение и проносим петлю через пламя, перемещая ее по мере раскаливания рабочей части;

проводим петледержателя несколько раз через пламя.

4. В левую руку возьмите пробирку с культурой.

5. Мизинцем правой руки обхватите пробку и откройте пробирку.

6. Пронесите открытую часть пробирки через пламя спиртовки, прожигая края.

7. Введите петлю в пробирку, охладите ее, касаясь изнутри стенок пробирки.

8. Снимите петлей небольшое количество культуры с поверхности агара (либо сделайте забор материала из жидкой среды).

9. Аккуратно извлеките петлю из пробирки.

10. Пронесите открытую часть пробирки через пламя спиртовки, прожигая края, и закройте пробирку пробкой и поставьте в штатив.

11. Петлю погрузите в каплю физраствора, равномерно распределите по стеклу, делая тонкий мазок в виде небольшого круга (d»2см). Если культура выращена в жидкой среде, физраствор на предметное стекло не наносят.

12. Простерилизуйте петлю в пламени и поставьте в штатив.

13. После полного высушивания мазок фиксируют.

 

Простые методы окраски

1. После охлаждения предметного стекла нанесите 1-2 капли водного раствора фуксина (для окраски кишечной палочки) или метиленового синего (для окраски стафилококка) на фиксированный мазок (чтобы он был полностью покрыт краской).

2. Окрашивайте в течение 2-3 минут.

3. Смойте краску водой.

4. Просушите препарат фильтровальной бумагой.

Водный раствор фуксина окрашивает микроорганизмы в красный цвет.

Раствор метиленового синего окрашивает микроорганизмы в синий цвет.

 

 

Занятие № 2

Окраска по Граму

 

Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:

1. Приготовление мазка из смеси культур стафилококка и кишечной палочки (см. Занятие №1).

2. Окраска по Граму, микроскопия и зарисовка препарата.

Сложные методы окраски

Алгоритм окраски по Граму

1. На зафиксированный мазок поместите сухую фильтровальную бумагу, пропитанную раствором генцианвиолета.

2. Нанесите на нее 2-3 капли воды так, чтобы бумага хорошо намокла и плотно прилегала к поверхности предметного стекла.

3. Через 2 мин снимите фильтровальную бумагу, слейте остатки красителя в кювету.

4. Нанесите раствор Люголя на 1 мин, слейте в кювету.

5. Обесцвечивание – нанесите на мазок несколько капель спирта на 20 сек.

6. Тщательно промойте препарат водой.

7. Нанесите водный раствор фуксина на 2 мин.

8. Промойте препарат водой.

9. Просушите фильтровальной бумагой.

Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет.

Грамотрицательные микроорганизмы окрашиваются в красный цвет.

 

Занятие № 3

Окраска по Цилю-Нильсену

Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:

1. Приготовление мазка из культуры бацилл.

2. Окраска мазка по Цилю-Нильсену, микроскопия и зарисовка препарата.

3. Микроскопия мазков из культуры клебсиелл, окрашенных по Бурри-Гинсу.

4. Микроскопия мазков из культуры стрептомицетов, окрашенных фуксином.

5. Микроскопия мазков из культуры микобактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену.

 

Сложные методы окраски

Алгоритм окраски по Цилю-Нильсену

1. На фиксированный мазок поместите сухую фильтровальную бумагу.

2. Нанесите на бумагу 3-4 капли карболового фуксина Циля.

3. Удерживая предметное стекло рукой за один из концов, нагрейте препарат над пламенем спиртовки до появления пара (повторите эту процедуру 3 раза).

4. После охлаждения стекла снимите фильтровальную бумагу и промойте мазок водой.

5. Погрузите препарат аккуратно в 1% раствор серной кислоты (для окраски спор) - три раза по 1 секунде.

6. Обильно промойте препарат водой.

7. Нанесите на мазок 2-3 капли водного раствора метиленового синего на 3 мин.

8. Промойте препарат водой. Просушите фильтровальной бумагой.

Вегетативная клетка бацилл окрашивается в синий цвет, споры - в красный.

Занятие № 4

ФИЗИОЛОГИЯ ПРОКАРИОТ

Окраска по Нейссеру

Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:

1. Приготовление мазка из культуры коринебактерий.

2. Окраска по Нейссеру, микроскопия и зарисовка препарата.

 

Сложные методы окраски

Алгоритм окраски по Нейссеру

1. На фиксированный мазок нанесите 2-3 капли ацетата метиленового синего Нейссера. Окрашивайте от 3 до 5 минут. Слейте краситель (можно промыть водой).

2. Нанесите раствор Люголя на мазок на 30 сек. Слейте краситель.

3. Промойте препарат водой.

4. Для докрашивания на мазок нанесите раствор везувина на 5 мин.

5. Промойте препарат водой. Просушите фильтровальной бумагой.

Зерна волютина окрашиваются в темно-синий цвет (выглядят коричневыми на фоне желтой цитоплазмы).

Цитоплазма бактерий окрашивается в желтый цвет.

 

Занятие № 5

Фаготипирование бактерий.

Испытуемую суточную буль­онную культуру бактерий в количестве 0,5 мл вносят в про­бирку с расплавленным и охлажденным до 45° С 0,7% мясо-пептонным агаром, перемешивают и равномерно распреде­ляют по поверхности 2% мясо-пептонного агара в чашке Петри.

После застывания агара чашку слегка подсушивают в термостате, затем стеклянное дно чашки делят на квадраты, надписывают номера (или названия) фагов, которые будут использоваться для типирования. Переворачивают чашку, приоткрывают крышку и на обозначенные квадраты пастеров­ской пипеткой наносят по одной капле соответствующих надписи фагов.

После суточной инкубации просматривают чашку, отмечая те квадраты, в которых имеется лизис бактерий.

Фаготип бактериальной культуры определяется тем типом (типами) фага, который вызывает ее лизис.

Занятие № 6

ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ

Метод «раздавленной» капли.

На поверхность чистого предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покров­ным стеклом. Капля должна быть небольшой и не выходить за края покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40х или 100х (с иммерсией).

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микро­бов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем приготавливают препарат «висячей» или «раздавленной» капли и микроскопируют.

 

ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

ОСНОВЫ УЧЕНИЯ ОБ ИНФЕКЦИИ

Иммунология

Занятие № 11

ИММУНОЛОГИЯ КАК НАУКА. ЕСТЕСТВЕННЫЙ ИММУНИТЕТ

Реакция преципитации

Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:

1. Постановка и учет реакции преципитации по Асколи.

 

Алгоритм проведения РП по Асколи

В узкую пробирку диаметром 0,5 см с неразведенной преципитирующей сывороткой в количестве 0,3 -0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена.

Пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально.

При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку возникает четкая граница между двумя слоями жидкости.

Реакцию учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1 - 2 ч или через 20 - 24 ч.

При положительной реак­ции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым эк­страктом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.

 

Реакция преципитации в геле

РПГ ставится на гелевых пластинах или на чашках Петри (метод Оухтерлони).

В ка­честве геля для реакции используют 1 % хорошо отмытый про­зрачный агар.

Антигены и сыворотки вносятся в агаровый гель так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном расстоянии.

Диффундируя навстречу друг другу и соединяясь друг с другом, антитела и антигены образуют иммунологический комплекс в виде белой полосы.

При наличии сложного по составу преципитиногена его предварительно делят на составные компоненты в реакциях иммуноэлектрофореза.

Занятие № 16

ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ. ОСОБЕННОСТИ ТРАНСПЛАНТАЦИОННОГО И ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА

АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ

Вирусология

Занятие № 29

ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ

РЕТРОВИРУСЫ

Вирусологическая диагностика ВИЧ-инфекции (СПИДа)

Практический навык, осваиваемый студентами на занятии:

1. Повторение алгоритма постановки иммуноферментного анализа (см. Занятие №17).

Занятие № 32

ПИКОРНАВИРУСЫ

ДНК-ГЕНОМНЫЕ ВИРУСЫ

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Основная:

1. Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: Учебник / Л.Б. Борисов [и др.] – М.: Медицина, 2002. – 736 с.

2. Борисов, Л.Б. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / Под ред. Л.Б. Борисова, 1994. – 256 с.

3. Воробьев, А.А. Микробиология: Учебник / А.А. Воробьев [и др.] – М., 1998. – 336 с.

4. Воробьев, А.А. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие для студентов медицинских вузов/А.А. Воробьев, А.С. Быков – М.: Медицинское информационное агентство, 2003. – 236 с.

5. Горецкая, М.В. Общая иммунология в схемах и таблицах: учебное пособие/ М.В. Горецкая, А.И. Жмакин. – Гродно: ГрГМУ, 2008 – 140 с.

6. Жмакин, А.И. Общая микробиология: учебное пособие/ А.И. Жмакин, В.М. Шейбак, С.А. Островцова. – Гродно: ГрГМУ, 2009 – 160 с.

7. Павлович, С.А. Медицинская микробиология. Практикум/ С.А. Павлович, К.Д. Пяткин. 1993. – 200 с.

Дополнительная:

1. Жмакин, А.И. Бактериология в схемах и рисунках: пособие / А.И. Жмакин, М.В. Горецкая. – Гродно: ГрГМУ, 2006 – 180 с.

2. Жмакин, А.И. Вирусология в схемах и рисунках: учеб. пособие / А.И. Жмакин, С.А. Островцова, М.В. Горецкая. – Гродно: ГрГМУ, 2006 – 122 с.

3. Павлович, С.А. Микробиология с вирусологией и иммунологией: учеб. пособие / С.А. Павлович. – Мн.: Выш. шк., 2005. – 799 с.

4. Ройт, А. Иммунология. / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. Пер. с англ. – М.: Мир, 2000. – 592 с.

5. Тотолян, А.А. Клетки иммунной системы. / А.А. Тотолян, И.С. Фрейдлин. СПб.: Наука, 2000. – 231 с.

6. Ярилин, А.А. Основы иммунологии: Учебник. / А.А. Ярилин – М.: Медицина, 1999. – 608 с.

СОДЕРЖАНИЕ

 

ВВЕДЕНИЕ.. 3

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ.. 4

МИКРОБИОЛОГИЯ КАК НАУКА БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ.. 9

МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ.. 10

МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ (ПРОДОЛЖЕНИЕ). ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ АКТИНОМИЦЕТОВ, СПИРОХЕТ, РИККЕТСИЙ, ХЛАМИДИЙ, МИКОПЛАЗМ... 11

ФИЗИОЛОГИЯ ПРОКАРИОТ. 12

ФИЗИОЛОГИЯ ПРОКАРИОТ (ПРОДОЛЖЕНИЕ). БАКТЕРИОФАГИ.. 15

ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ.. 18

ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.. 20

ОСНОВЫ УЧЕНИЯ ОБ ИНФЕКЦИИ.. 22

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИОТЕРАПИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ 23

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЕ ВОПРОСЫ ПО ОБЩЕЙ МИКРОБИОЛОГИИ.. 25

ИММУНОЛОГИЯ КАК НАУКА. ЕСТЕСТВЕННЫЙ ИММУНИТЕТ. 27

ИММУННАЯ СИСТЕМА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА.. 28

КЛЕТОЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ. АНТИГЕНЫ... 29

ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ. ИММУНОГЛОБУЛИНЫ... 30

АЛЛЕРГИЯ (ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ) 32

ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ. ОСОБЕННОСТИ ТРАНСПЛАНТАЦИОННОГО И ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА.. 33

ИММУНОПРОФИЛАКТИКА И ИММУНОТЕРАПИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА.. 35

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЕ ВОПРОСЫ ПО ИММУНОЛОГИИ.. 38

СТАФИЛОКОККИ. СТРЕПТОКОККИ. НЕЙССЕРИИ.. 40

КИШЕЧНАЯ ПАЛОЧКА. ШИГЕЛЛЫ. САЛЬМОНЕЛЛЫ... 41

УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИИ. ПСЕВДОМОНАДЫ. КАМПИЛОБАКТЕРЫ. ГЕЛИКОБАКТЕР. 43

ВИБРИОНЫ. БРУЦЕЛЛЫ. ФРАНЦИСЕЛЛЫ. YERSINIA PESTIS. БАЦИЛЛЫ... 45

МИКОБАКТЕРИИ. АКТИНОМИЦЕТЫ. ЛИСТЕРИИ.. 47

АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ.. 48

КОРИНЕБАКТЕРИИ. БОРДЕТЕЛЛЫ. ГЕМОФИЛЫ. ЛЕГИОНЕЛЛЫ... 50

СПИРОХЕТЫ. БАРТОНЕЛЛЫ. ОРИЕНЦИИ. ЭРЛИХИ. РИККЕТСИИ. ХЛАМИДИИ. МИКОПЛАЗМЫ 51

ПАТОГЕННЫЕ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ГРИБЫ И ПРОСТЕЙШИЕ.. 53

ИТОГОВОЕ ЗАНЯТИЕ ПО РАЗДЕЛУ «БАКТЕРИОЛОГИЯ». 54

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЕ ВОПРОСЫ ПО МЕДИЦИНСКОЙ БАКТЕРИОЛОГИИ С ОСНОВАМИ МИКОЛОГИИ И ПРОТОЗООЛОГИИ.. 55

ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ.. 60

ОРТОМИКСОВИРУСЫ. ПАРАМИКСОВИРУСЫ. КОРОНАВИРУСЫ. ВИРУС
КРАСНУХИ.. 61

РЕТРОВИРУСЫ... 62

ПИКОРНАВИРУСЫ... 63

ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ГРУППА АРБО- И РОБОВИРУСОВ. РАБДОВИРУСЫ.
РЕОВИРУСЫ... 64

ДНК-ГЕНОМНЫЕ ВИРУСЫ... 65

ВИРУСЫ ГЕПАТИТОВ. ОНКОГЕННЫЕ ВИРУСЫ... 66

МЕДЛЕННЫЕ ИНФЕКЦИИ. КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ.. 67

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЕ ВОПРОСЫ ПО ВИРУСОЛОГИИ.. 69

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА.. 71

Для заметок

Для заметок

 

 

Учебное издание

 

 

Жмакин Андрей Игоревич

Горецкая Марианна Викторовна

 

 

ТЕТРАДЬ

ПРАКТИЧЕСКИЙ НАВЫК ПО МИКРОБИОЛОГИИ

 

для студентов лечебного, педиатрического факультетов

и факультета иностранных учащихся

 

Общая МИКРОБИОЛОГИЯ