Способ осуществления физической нагрузки крыс.

Одна из групп крыс, подвергаемая стресс-тесту получала физическую нагрузку. Перед проведением данной части эксперимента крысам проводили измерения веса.

Физическая нагрузка животных осуществлялась в тесте «Вынужденное плавание с грузом». Суть которой заключалась в том, что крысы выполняли плавательный упражнения- животные помещались в воду с грузом, составляющей примерно 7% от массы тела, прикрепленным к туловищу тела при помощи веревки. Массу груза определяли с точностью до 2-3 г. При наблюдении за животными засекали время их нахождения в воде, в нашем эксперименте оно составляло около7- 9 минут, но критическим определением времени нахождения крыс в воде являлся момент, когда животное было не в состоянии удержаться над поверхностью воды самостоятельно, уставая, животное начинало погружаться под воду все чаще и чаще, начиная тонуть. Утомление часто сопровождалось нарушением моторно-координационной функции. Именно этот момент мы брали за точку окончания эксперимента, который в редких случаях мог составлять и 5 мин. Далее крыс вынимали из воды, обсушивали полотенцем, клали обогреваться в воду, с комфортным для них параметром температуры (около 40 ˚С), далее крысы обсушивались в сухом контейнере, располагающемся около обогревателя для полного высыхания шерсти, после чего крысы помещались в клетки.

Плавание проводили в бассейне из пластмассы с внутренним диаметром около 1,5 м и высотой 75 см. Высота столба воды составляла 60 см, температура воды- 20-24 С. Животные в бассейне исследовались по 2-5 особи.

Животные этой группы плавали на каждый 4 день эксперимента. Время плавания животных по сравнению с фоновым показателем со временем увеличивалось, поэтому нахождение крыс в воде было увеличено до 10-12 минут, это можно объяснить адаптацией животных к новой среде и постепенным увеличением физической выносливости на фоне запредельных нагрузок.

Выделение РНК

Кровь собирали в пластиковые пробирки с антикоагулянтом 0,1 М раствора EDTA-К3 (pH 7,3) в соотношении кровь/антикоагулянт 1/100. Забор крови проводили также в виварии КГМУ. В латеральную хвостовую вену или в вентральную/дорсальную артерию устанавливались иглы шприца, для забора крови. Для улучшения кровообращения и быстрому выделения образцов крови хвост прогревался в теплой воде.

Образцы крови выделялись для определения изменения экспрессии генов серотониновой системы, и для анализа уровня гормона стресса (кортизола). ExtractRNA - монофазный водный раствор фенола и гуанидин-изотиоцианата, предназначенный для быстрого выделения суммарной РНК высокого качества.

Добавленный к образцу реагент моментально лизирует клетки, при этом целостность РНК сохраняется за счет высокоэффективного ингибирования активности РНКаз. В процессе денатурации все клеточные компоненты переходят в гомогенат, а затем, после добавления хлороформа и последующего центрифугирования, эмульсия разделяется на водную фазу, интерфазу и органическую фазу, при этом РНК, ДНК и белки оказываются в разных фазах.

Суммарная РНК, выделенная с помощью реагента ExtractRNA была использована для синтеза кДНК.

 2.2.3.1. Протокол выделения суммарной РНК

Гомогенизация пробы: гомогенизировали образец в растворе ExtractRNA, инкубировали лизат при комнатной температуре в течение 10-15 мин, чтобы произошла полная диссоциация нуклеопротеидных комплексов, далее центрифугировали лизат при 12 000-15 000 g в течение 10 минут для удаления нерастворенных фрагментов. Супернатант перелили в новую пробирку.

Разделение фаз: Добавили 0.2 мл хлороформа на каждый 1 мл реагента ExtractRNA, добавленного на этапе гомогенизации. Закрыли пробирку, активно перемешивая содержимое пробирки с помощью встряхивания (вручную) в течение 15 секунд. Инкубирова смесь в течение 3-5 минут при комнатной температуре, периодически встряхивая образец. Центрифугировали образец при 12 000 g в течение 15 минут при 4°C. В ходе центрифугирования произошло разделение смеси на три фазы. РНК находится в водной фазе (верхняя), составляющей 45-50% от общего объема смеси. Держа пробирку наклонно (под углом 45°), аккуратно отобрали водную фазу. Переместили водную фазу в новую пробирку.

Выделение РНК: Добавили в водную фазу 0.5 мл 100% изопропанола на каждый 1 мл реагента, использованного для гомогенизации. Инкубировали смесь при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифугировали образцы при 12 000 об. в течение 10 мин при комнатной температуре. Тщательно отобрали супернатант, оставив осадок РНК на дне пробирки. Аккуратно, по стенке пробирки, добавили 2 мл 75% этанола на каждый 1 мл изопропанола. Образцы центрифугировали на максимальной скорости в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалили этанол. Высушили осадок на воздухе в пробирке с открытой крышкой в течении 5-7 мин. Растворите РНК в необходимом объеме свободной от РНКаз воды. Перемешали раствор пипетированием для лучшего расторения осадка. Встряхивали раствор на вортексе, сбросив капли центрифугированием. Заморозили образец.

Синтез кДНК

Для синтеза кДНК использовали вырожденные праймеры с использованием MMLV RT kit (Евроген, Россия).

Набор реактивов предназначен для синтеза первой цепи кДНК на РНК-матрице. Набор содержит обратную транскриптазу вируса лейкемии мышей (MMLV ревертаза). Фермент получен из рекомбинантного штамма Е. coli, экспрессирующего ген MMLV ревертазы дикого типа.

Свойства MMLV ревертазы:

Осуществляет синтез комплементарной цепи ДНК на РНК-матрице (РНК зависимая ДНК полимераза).

Обладает слабой активностью РНКазы H.

Позволяет синтезировать фрагменты кДНК длиной до 5 т.п.о.

Обеспечивает высокий выход кДНК: при использовании 100 ед. фермента на 1 мкг РНК выход реакции составляет не менее 100 нг первой цепи кДНК.