Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Технологическая цепочка - Последовательность действий ПЦР
Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходят изменения, которые обеспечиваются температурными условиями реакции. Каждый цикл амплификации состоит из трех последовательных изменений температуры - этапов: 1. Денатурация 95 о С – обратимая денатурация - расплетание двухнитевой ДНК и превращение в однонитевую путем разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований противоположных цепей ДНК под воздействием высоких температур. 2.Отжиг 62-65 о С – это присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры подбирают так, чтобы они ограничивали искомый фрагмент ДНК и были 3. Элонгация (синтез) 72 о С. После отжига праймеров Taq-полимераза начиначинает достраивание второй цепи ДНК с 3'-конца праймера с использованием дНТФ. Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается. Эффект плато Процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает – проявляется эффект плато. Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3–1 пмоль. КРИТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ПЦР Температурный режим Преактивация: Выдерживание реакционной смеси перед началом ПЦР в течении 0,5-10 минут при 92оС позволяет инактивировать примесные белки и способствует более полной денатурации матричной ДНК Выдерживание реакционной смеси в течении 5-10 минут при температуре 72оС для полного завершения синтеза продуктов ПЦР Количество циклов Факторы уменьшающие скорость роста количества продукта ПЦР: o Истощение субстрата (дНТФ или праймеров) o Ингибирование ПЦР конечными продуктами реакции o Конкуренция за субстрат со стороны неспецифичных продуктов реакции o Неполная денатурации дцДНК o Стабильность компонентов реакции
o «Изнашивание» ДНК-полимераз o Увеличение вязкости реакционной смеси (препятствует элонгации праймеров) Ионы двухвалентных металлов Объем реакционной смеси Матричные нуклеиновые кислоты ПОЧЕМУ ЭТО ВАЖНО? Неверный подбор условий и компонентов ПЦР приводит к образованию побочных продуктов реакции, «шмира», димеров праймеров, низкому выходу или полному отсутвию продуктов реакции. ШМИР: Неспецифические продукты ПЦР:
ЕСЛИ ВСЕ ПРАВИЛЬНО
ПЦР с обратной транскрипцией - история открытия и термины Обратная транскрипция — это процесс образования двуцепочечной ДНК на основании информации в одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так как передача генетической информации при этом происходит в «обратном», относительно транскрипции, направлении. Идея обратной транскрипции вначале была очень непопулярна, так как противоречила центральной догме молекулярной биологии, которая предполагала, что ДНК транскрибируется в РНК и далее транслируется в белки. Однако в 1970 году Хауард Мартин Темин и Дейвид Балтимор, американские ученые, независимо друг от друга открыли фермент, названный обратной транскриптазой (ревертазой), и возможность обратной транскрипции была окончательно подтверждена. В 1975 году Темину и Балтимору была присуждена Нобелевская премия в области физиологии и медицины. Обратная транскрипция является необходимым этапом жизненного цикла РНК-вирусов. Она позволяет перевести РНК-геном вируса в ДНК, с которой уже можно производить транскрипцию вирусных мРНК и новых геномных РНК. Ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза — фермент (КФ 2.7.7.49), катализирующий синтез ДНК на матрице РНК в процессе, называемом обратной транскрипцией. Обладает активностью РНКазы Н (т.е. разрушает цепь РНК, входящую в состав ДНК/РНК-дуплекса). Подобно всем ДНК-полимеразам функционирует только при наличии затравки (праймера). Денатурация или плавление - расхождение цепей ДНК при нагревании ДНК или при повышении pH. Расхождение цепей происходит из-за разрушения слабых водородных связей и плоскостных взаимодействий между основаниями.
Денатурация – процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс воссоединения, называемый ренатурацией, реассоциацией или отжигом, происходит при понижении температуры или рН. • При резком понижении температуры или рН правильное воссоединение комплементарных цепей затрудняется из-за спаривания оснований локально комплементарных участков в пределах одной или разных цепей. • При ренатурации сначала соединяются участки цепей с повторенной ДНК и затем с уникальными участками • Если совместно отжигают одноцепочечные ДНК, происходящие из различных источников, то формирование двухцепочечной структуры ДНК называют гибридизацией.
|
||||||
Последнее изменение этой страницы: 2021-05-27; просмотров: 160; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.116.8.110 (0.005 с.) |