Использование интеркалирующих агентов

Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации.

Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмер). Для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с помощью построения так называемых "кривых плавления" (melting curves).

 

Кривые плавления

Для оценки специфичности метода ПЦР в режиме реального времени проводится постамплификационный анализ кривых плавления. Анализ кривой плавления позволяет оценить специфичность амплификации, отличить ПЦР-продукты от димеров праймеров и обнаружить загрязнения. Наличие одного четко выраженного пика кривых плавлений свидетельствует о специфичности использованных праймеров.

Для этого после окончания ПЦР реакционную смесь нагревают и непрерывно измеряют флуоресценцию. По достижении температуры плавления продукта амплификации флуоресценция резко снижается.

Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов. Для облегчения работы с полученной информацией проводят дифференциальный анализ кривой плавления. Такой способ визуализации полученных данных гораздо удобнее для понимания и анализа.

Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификации с помощью бромистого этидия и SYBR Green I. При использовании кривых плавления в системах с ДНК-зондами (Taq-man assay, beacons) возможно различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Наличие таких мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и к изменениям в графике кривой плавления. Использование кривых плавления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с пробирками, а интерпретация полученных данных автоматизирована и формализована.

Подводя итоги стоит отметить следующее: использование ДНК-зондов в том или ином варианте является наиболее предпочтительным в свете повышения специфичности анализа. Однако к недостаткам зондов относится высокая стоимость, что делает работу по подбору зондов, праймеров и условий амплификации дорогостоящей. Вместе с тем, использование интеркалирующих агентов является очень простым и дешевым. Отпадает необходимость подбора специальных праймеров, зондов, так как можно пользоваться уже используемыми праймерами, эффективность работы которых уже проверена. Эти обстоятельства делают применение интеркалирующих агентов весьма привлекательным.

Изотермальная ПЦР или LAMP

Разработан новый тест, в котором вместо ОТ-ПЦР используется технология петлевой изотермальной амплификации нуклеиновых кислот (LAMP - Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) of DNA or RNA (RT-LAMP) targets.). Поскольку реакция протекает при постоянной температуре, этот метод может дать положительные результаты всего за 5 минут и отрицательные результаты за 13 минут.

 

Цифровая ПЦР

Метод проведения ПЦР с регистрацией результатов в реальном времени (количественная ПЦР, qPCR, real-time PCR) для количественного определения фрагментов ДНК в образце прочно закрепился в практике лабораторных и научных исследований.

Современным альтернативным методом для решения подобных задач является цифровая ПЦР.