Аналитический этап - Основные компоненты

Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как
правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные (комплементарные) противоположным концам противоположных цепей искомого участка ДНК-мишени. Служат затравкой для синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы и играют ключевую роль в образовании и накоплении продуктов реакции амплификации.
Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы и должны отвечать ряду критериев:

► быть специфичными, для этого основным условием является адекватно подобранный фрагмент, который предполагается накапливать – он должен быть консервативным, не изменяться при переходе от хозяина к хозяину, под воздействием антибиотиков и др. При недостаточной специфичности праймеров в процессе ПЦР будут образовываться продукты, которые, с одной стороны, могут быть идентифицированы как ложноположительный результат, а с другой стороны, на процессы их накопления будут расходоваться компоненты реакционной смеси,
что приведет к значительной потере чувствительности реакции как таковой;
► область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или
инсерцийв пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве
критерия при выборе праймеров. При попадании в такую зону не происходит
отжига праймеров и, как следствие, возникает ложноотрицательный результат.
► не должны образовывать димеры и петли– устойчивые двойные цепи –
при отжиге праймеров самих на себя или друг с другом;
Taq-полимераза – термостабильный фермент, который обеспечивает достраивание 3'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – дезоксиаденозинтрифосфат
(дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ)
и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) – строительный материал, используемый Taqполимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.
Анализируемый образец – подготовленный к внесению в реакционную смесь
препарат, который может содержать искомую НК, например ДНК микроорганизмов,
служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии НК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

Положительный контрольный образец (ПКО) представляет собой искусственно синтезированную олигонкулеотидную последовательность, строго соответствующую искомой. Соответственно, праймеры для ПКО и искомой мишени одинаковые, что позволяет удостовериться в работоспособности и сохранности компонентов РС, необходимых для нормального прохождения ПЦР.
Отрицательный контрольный образец (ОКО) включает в себя все компоненты
реакции, но вместо клинического материала или препарата НК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемую ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации и исключения учета ложноположительных результатов.

Внутренний контроль - это искусственно сконструированный препарат ДНК или РНК, который имеет принципиально отличную от искомой олигонуклеотидную последовательность, добавляется вместо биопробы. Внутренний контроль необходим, поскольку биопроба может содержать ингибиторы, в присутствии которых ПЦР мало или совсем не эффективна. Кроме того, возможны ошибки на этапе составления РС (например, не добавили какой-либо компонент или саму НК), несоблюдение температурного режима хранения наборов реагентов или отдельных их частей (например, размораживание и потеря активности ферментов) и ряд других технических моментов, которые напрямую влияют на результаты ПЦР. Поэтому становится необходимым контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью.

КРИТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ПЦР

При практическом использовании ПЦР, по крайней мере, три характеристики данного метода важны для исследователя:

• Специфичность реакции – продуктом ПЦР должен быть именно тот локус ДНК, который амплифицировали, других продуктов от ПЦР быть не должно (при этом не обращают внимание на ошибочно включенные, в результате работы полимеразы, нуклеотиды);

• •Точность синтеза ДНК – ошибки в амплификафии недопустимы при определении первичной структуры аплифицированного локуса, или при использовании продукта ПЦР для синтеза кодируемого им белка в генно-инженерных системах экспресии;

• • • Эффективность синтеза ДНК – количественно оценивается по выходу продукта после окончании реакции. Теоретически через n циклов количество продуктов ПРЦ достигнет 2n-1 штук с каждой молекулы кДНК. Однако на практике такое происходит редко.

ДИЗАЙН ПРАЙМЕРОВ

В большинстве случаев необходимая длина праймеров составляет 18-30 нт, но для некоторых исследований применяют более длинные праймеры. Дизайн праймеров в настоящее время во многом облегчен благодаря специализированным компьютерным программам. Но ни одна из них не освобождает исследователя от необходимости мыслить при решении собственных задач.

1-Температура отжига праймера: ГЦ-состав праймера определяет температуру отжига праймера на кДНК и должен находится в пределах 35-65% (идеально 45-55%). Хотя состав праймера определяется первичной структурой кДНК, в случае если состав матрицы оказывается сильно смещенным в сторону А-Т или Г-Ц пар, допускается добавление к 5’-концу праймера нескольких Г-Ц или А-Т остатков, не комплементарных матрице. Для расчета температуры отжига праймеров используют следующую формулу: [4(Г+Ц)+2(А+Т)]-5^оС, при длине праймера ≤ 20 нт, или 62,5 + 0,41^оС(%Г-Ц) при длине праймера ≥ 20 нт.;

2-Желательно, чтобы температуры отжига пары праймеров для ПЦР совпадали, хотя допускается различие в 4-6^оС;

3-При выборе мест отжига праймеров на матрице необходимо избегать участков, которые в одноцепочечной форме образуют вторичную структуру;

4-Для эффективной ПЦР не требуется полной комлементарности матрице, хотя полное соответствие желательно. В связи с этим допускается присоединение к 5’-концам праймеров участков, заключающих сайты рестрикции, кодоны инициации и терминации транскрипции;

5-Включение Г или Ц остатков на 3’-конец праймера повышает вероятность неспецифичного отжига праймера на матрице;

6-Недопустима самокомлементарность праймеров, особенно в 3’-концевых областях, так как это приводит к образованию димеров праймеров и уменьшению их эффективности;

7-Ионные условия при проведении ПЦР должны подбираться индивидуально для каждой новой пары праймеров

8-Стандартные концентрации праймеров в реакционной смеси составляют 0,1-1 мкМ, увеличение концентрации обычно в большинстве случаев дает хорошие результаты, однако это делает дороже пробу.

Полимеразы

Методология ПЦР подразумевает использование термостабильных ДНК-полимераз.

Выбор конкретной полимеразы зависит от целей конкретного эксперимента.

ДНК-полимеразы, с более высокой точностью синтезирующие ДНК, как правило, обладают 3’ → 5’ экзонуклеазной активностью. Несмотря на высокую точность действия этих ферментов, только с ними не работают по ряду причин. Основная из них – неспецифический гидролиз праймеров, происходящий под действием корректирующей эндонуклеазы.

Использование Taq-полимеразы в смеси (50:1) с более корректно работающими ферментами позволяет уменьшить скорость деградации праймеров и значительно повысить точность синтеза ДНК.

Увеличение концентрации фермента в пробе приводит к увеличению вероятности появления в смеси неспецифический продуктов реакции